מודל ex vivo explant לחקר אינטראקציות גליה ברשתית העכבר

אנו רוצים להבין את הדלקת העצבית בגלאוקומה, הגורם המוביל לעיוורון בלתי הפיך ברחבי העולם. באופן ספציפי, אנו חוקרים כיצד תאי תמיכה בגליה ברשתית משפיעים על אובדן עצבי במהלך התקדמות המחלה.

גליה כמו אסטרוציטים ומיקרוגליה נחשבים כמשפיעים על התקדמות הגלאוקומה, אך רבים מהכלים המשמשים לחקר תפקוד עצבי במודלים של בעלי חיים אינם מתאימים לתאים אלה. צמחי רשתית משמשים לחקר דלקת עצבית ותפקוד גליה, אך עקומת הלמידה תלולה. הפרוטוקול שלנו הופך אותו לנגיש יותר ובתקווה מאפשר אימוץ רחב יותר של הטכניקה.

בהשוואה לתרבית תאים מסורתית במבחנה, גישת האקספלנט שלנו משמרת טוב יותר את הסביבה הטבעית של התאים ברשתית הפנימית, ומאפשרת חקירה מדויקת יותר של התפקודים הפיזיולוגיים שלהם.

[קריין] כדי להתחיל, הניחו את עין העכבר שחולצה בכלי דיסקציה מלא ב- PBS סטרילי בטמפרטורת החדר. זהה נקודת אחיזה מתאימה ותפס אותה בעזרת מלקחיים זוויתיים, ולאחר מכן מקם בעדינות את העין על מגבון המעבדה השקוע תוך הקפדה על מיקום אופקי של הציר הקדמי-אחורי מהקרנית לעצב הראייה. תוך שמירה על אחיזה איתנה עם מלקחיים זוויתיים, השתמש בקצה של אזמל מספר 11 כדי לבצע חתך מקביל וכ-0.5 מילימטר אחורי ללימבוס שבו הקרנית עוברת לסקלרה. הכנס להב אחד של המספריים הקפיציים לתוך הגלובוס וחתוך בצורה היקפית סביב העין, ומקם מחדש לפי הצורך בעזרת מלקחיים. לאחר השלמת החיתוך ההיקפי, הסר את הקטע הקדמי והעדשה בעזרת מלקחיים. אם נותרה חתיכה ארוכה של עצב הראייה, חתוך אותה לאורך של מילימטר עד שניים בעזרת מספריים עדינים. לאחר מכן סובבי את גביעונית העיניים כך שהיא פונה כלפי מעלה כדי לאפשר בדיקה ויזואלית ולהקל על הסרת הזגוגית. המשיכו להשתמש במלקחיים זוויתיים כדי לשתק את העין ובדקו את הרשתית לאיתור נזק נראה לעין ובדקו את תא הזגוגית לאיתור פסולת תאים פיגמנטיים מפיגמנט הרשתית, אפיתל או כורואיד. בעזרת פיפטת העברה שונה, שטפו את תא הזגוגית עם PBS, תוך שמירה על קצה הפיפטה שקוע כדי למנוע בועות אוויר. לאחר מכן, בעזרת מברשת צבעי מים עדינה, הסר בעדינות פסולת גדולה יותר תוך מזעור המגע עם הרשתית. עבור פסולת מתמשכת, השתמש במלקחיים בעלי קצה עדין בזהירות, הימנע ממגע מתכת ישיר עם הרשתית. לאחר פינוי פסולת גלויה, שטפו את תא הזגוגית עם PBS מפיפטת ההעברה שלוש עד חמש פעמים והשתמשו במברשת העדינה כדי לחקור ליד ההיקף אחר שאריות של אלמנטים בגוף הריסי, ולזהות זגוגית על ידי הגרר על סיבי המברשת. אם נותרו כיסי זגוגית, יש לטאטא החוצה לכיוון ההיקף בעזרת המברשת, תוך שמירה על הסיבים נגררים בזווית רדודה כדי למנוע נזק לרשתית. החזיקו זוג מלקחיים במצב סגור כשהקצוות נוגעים זה בזה והכניסו אותם בעדינות בין הרשתית לכורואיד באמצעות כל רווח טבעי שנוצר במהלך הטיפול. השתמש בזרועות השטוחות של המלקחיים כדי להגדיל בהדרגה את המרווח בין הרשתית לכורואיד עד להשגת הפרדה מלאה. המשך לייצב את הדגימה עם זוג מלקחיים אחד תוך שימוש בזוג שני כדי למשוך בעדינות את העין, כולל הסקלרה והכורואיד, כלפי מטה. אם הרשתית יורדת עם העין, השתמש במלקחיים כדי לחקור בעדינות ולנתק את כל נקודות החיבור שנותרו, תוך הימנעות מראש עצב הראייה. לאחר מכן, כשהרשתית עדיין מעוגנת בראש עצב הראייה, המשיכו להחזיק את הרקמה יציבה והשתמשו בזוג המלקחיים השני כדי לקבץ את העין מתחת לראש עצב הראייה. בדוק כדי לוודא שהיקף הרשתית אינו מקופל עקב שאריות זגוגית, במיוחד באתרים שבהם נותר גוף רירי. במידת הצורך, שטפו את התא עם PBS באמצעות פיפטת העברה והשתמשו במברשת כדי לשחרר בעדינות כל רשתית מקופלת ולהסיר עודפי זגוגית. לאחר חשיפת הרשתית משני הצדדים, השתמש במספריים קפיציים כדי לבצע סדרה של חתכים מקלים במרחק של כ-90 מעלות מהיקף הרשתית לכיוון ראש עצב הראייה. תוך כדי החזקת הרקמה השקועה, השתמש במלקחיים כדי למשוך לרוחב את מגבון המעבדה מהדגימה ולהוציא אותו מהצלחת מבלי לגעת ברשתית. תוך כדי החזקת הרשתית במקומה, השתמש במספריים הקפיציים כדי לנתק את עצב הראייה ממש מתחת לרשתית. לאחר מכן הרם והסר בזהירות את רקמת העין שנותרה מהצלחת. כעת מלאו צלחת פטרי בגודל 35 מילימטר ב-PBS והשתמשו במלקחיים כדי למקם ריבוע פילטר בתחתית כשהצד המחוספס והמט פונה כלפי מעלה, תוך הימנעות מקמטים. לאחר מכן, בעזרת פיפטת ההעברה, שאפו בעדינות את הרשתית והעבירו אותה לתוך צלחת הפטרי. השתמש במברשת כדי לכוון את הרשתית כשהמשטח הפנימי פונה כלפי מעלה ולמקם אותה ישירות מעל ריבוע המסנן. שאפו לאט PBS כדי להוריד את הרשתית על המסנן. לאחר שהרשתית יושבת על המסנן, השתמש במברשת כדי לפרוש בעדינות את כל הקפלים ההיקפיים. התאימו את רמת ה-PBS כדי לאזן את יציבות הרשתית והלחות, מה שמאפשר תנועה חלקה של המברשת מבלי לייבש את הרקמה. כעת השתמש בפיפטת ההעברה כדי לטפטף PBS מגובה של כסנטימטר אחד מעל כדי לשטוף את פני השטח ולבדוק שוב את הרשתית לאיתור פסולת. סגור את מכסה צלחת ה-35 מילימטר ונשא אותו לארון הבטיחות הביולוגית. הנח את הכלי הסגור בתוך ארון הבטיחות הביולוגית מבלי לגעת במשטחים פנימיים או בציוד. עקר או החלף כפפות בעת מעבר לעבודה אספטית והעביר את צלחת שש הבארות הטעונה מראש במדיה חיצונית מהחממה לארון הבטיחות הביולוגית. בתוך הארון הסר את המכסה של צלחת ה-35 מילימטר והשתמש במלקחיים זוויתיים כדי להרים את ריבוע המסנן מבלי לגעת ברשתית. לאחר מכן פתח את צלחת שש הבארות והורד בעדינות את המסנן למרכז התוספת בבאר אחת, וטבל אותו לאט במדיה. לאחר שהרשתית נפרדת מהפילטר, הזיזו לאט את המסנן הצידה והוציאו אותו מהבאר באמצעות מלקחיים זוויתיים. השתמש בפיפטה של מיליליטר אחד כדי לשאוב 500 מיקרוליטר של מדיה מהתוסף, ולוכד את הרשתית בין התוסף לממשק האוויר-נוזל. לבסוף, החזר את המכסה על צלחת שש הבארות והחזיר אותו לחממה, וודא שהרשתית נשארת מרוכזת בתוך הבאר. כדי לבחון שינויים בקנה מידה גדול בגליה של הרשתית, הושוו רשתית שהושתלה במשך שלושה ימים עם צמחי דמה שנקבעו מיד לאחר הבידוד במקום לתרבת. מיקרוגליה ברשתית דמה הראתה דפוס תפוצה קבוע ולא חופף, בעוד שביום השלישי ארגון הרשתית המושתלת הפך לא סדיר עם תאים שנראו מקובצים, מה שמרמז על נדידה. אסטרוציטים ברשתית דמה הראו יישור הדוק עם כלי הדם, שהצטמצם משמעותית לאחר שלושה ימים במבחנה. ביטוי GFAP בתאי מולר היה קלוש או נעדר ברשתית דמה, אך נראה בבירור ביום השלישי במבחנה, במיוחד ליד קצוות הרקמות. לאחר יום אחד במבחנה, מיקרוגליה הראתה נסיגת תהליך וסימנים מוקדמים של הפעלה שהתקדמו למורפולוגיה אמבואידית קומפקטית ביום השלישי. לאחר 24 שעות, צפיפות תאי הגנגליון ברשתית שכומתה באמצעות Brn3a הראתה ירידה צנועה אך ניכרת בצמחי תרבית לעומת צמחים מזויפים. TMEM119, סמן מיקרוגליה הומאוסטטי, התבטא מאוד ברשתית דמה אך כמעט ולא ניתן היה לזהות אותו לאחר שלושה ימים במבחנה. ביטוי CD206, המסמן היאלוציטים, נשאר יציב לאחר שלושה ימים של תרבית במבחנה. צביעת GFAP חשפה תגובתיות של אסטרוציטים ותאי מולר סביב אתרי פגיעה מכנית שנגרמו במהלך נתיחה וטיפול.