בדיקת הכלאה מפוצלת המשתמשת באפטמר אור פלואורסצנטי של DNA כמדווח אותות לניתוח חומצות גרעין ספציפיות לרצף
July 8th, 2025
פרוטוקול זה מתאר את התכנון של בדיקות הכלאה מפוצלות תוך שימוש באפטמר מואר פלואורסצנטי DAP-10-42 כמדווח אותות ויישומם לזיהוי חומצות גרעין והבחנה בין מטרות עם החלפות נוקלאוטידים בודדים.
אנו מפתחים סוגים חדשים של בדיקות הכלאה פלואורסצנטיות לניתוח חומצות גרעין ספציפיות לרצף. לאחרונה, כלי ניתוח הכלאה התרחבו עם מבחנים המנצלים את מערכות CRISPR-Cas. נכון לעכשיו, בדיקות הכלאה מתקדמות, כגון TaqMan, ובדיקות משואות מולקולריות, משמשות בעיקר לניתוח מטרות של חומצות גרעין.
זיהוי מדויק של תחליפי נוקלאוטידים בודדים ומטרות חומצות גרעין עדיין מאתגר כמעט. הפרוטוקול שלנו מבטיח את הרמה הנדרשת של פעילות התא תוך מתן קריאת אות פלואורסצנטי ללא תוויות. כדי להתחיל, תכנן את הרצפים של שני גדילי אוליגונוקלאוטידים של DNA לא מותאמים המהווים SLAS.
השתמש בשבר המכיל נוקלאוטידים עבור 6 עד 39 של DAP-10-42. המר גזע 1 המורכב מנוקלאוטידים 1 עד 8 ו-36 עד 42 לגזע 1 ראשוני על ידי הסרת תימין בולט במיקום 5, קיצור הגבעול לארבעה זוגות בסיסים והוספת זוג בסיסים ציטוזין-גואנין טרמינלי. כלול נוקלאוטידים 9 עד 29 בגדיל SLAS אחד ונוקלאוטידים 30 עד 35 בשני.
הרחב את הרצף הסופי של שלושת הראשוניים של השבר עם נוקלאוטידים 9 עד 29 על ידי הוספת דאוקסי GGTCAT. לאחר מכן הרחב את רצף חמשת הטרמינלים הראשוניים של המקטע 30 עד 35 עם דאוקסי TGACC ליצירת גזע זוג שישה בסיסים 2. כעת הרחב את גזע 1 ראשוני בשני הגדילים עם מקשרים דאוקסי TT, ורצפי DNA משלימים למטרה של חומצת הגרעין.
זה מניב את רצפי הגדילים SLAS-U ו-SLAS-S המרכיבים את הבדיקה. הפוך את SLAS-S לחינם לאזור של 7 עד 10 נוקלאוטידים. זה כולל את אתר החלפת הנוקלאוטידים היחיד.
לאחר מכן ודא שזרוע קשירת המטרה של SLAS-U משלימה לשבר נוקלאוטידים של 15 עד 25 הסמוך לאזור SLAS-S. הערך את טמפרטורות ההיתוך של דופלקסי קשירת היעד באמצעות שרת האינטרנט UNAFold. לחץ על הכרטיסייה INAMelt.
עבור אל יישומים ובחר היברידיזציה של התכה של שני מצבים. הזן את הרצפים המקיימים אינטראקציה בסדר של חמישה ראשוניים עד שלושה ראשוניים בתיבות השמאלית והימנית. לאחר מכן התאם את טמפרטורת הבדיקה ל-22 מעלות צלזיוס והזן את ריכוזי הקטיונים החד-ערכיים והדו-ערכיים ליונים של 20 מילי-מולרי ו-25 מילי-מולארי, בהתאמה.
התאם את הריכוזים של רצפי האינטראקציה בתיבה המתאימה. לחץ על שלח וסקור את ערכי שינוי האנרגיה, האנטרופיה, האנטרופיה וטמפרטורת ההיתוך של גיבס עבור הדופלקסים המתאימים. ודא שטמפרטורות ההיתוך עבור מטרות תואמות לחלוטין וזרועות קשירת המטרה של SLAS-S ו-SLAS-U הן מעל טמפרטורת הבדיקה, 22 מעלות צלזיוס.
ודא שהדופלקס בין SLAS-S ליעד לא תואם מניב טמפרטורות התכה מתחת לטמפרטורת הבדיקה כדי לשמור על ספציפיות. במידת הצורך, התאם את אורכי זרועות קשירת המטרה כדי לעמוד בתנאים אלה. השג את גדילי האוליגונוקלאוטידים הסופיים של SLAS-U ו-SLAS-S מספק DNA מסחרי או סנתז אותם בתוך הבית באמצעות סינתיסייזר DNA אוטומטי.
הכן פתרונות מלאי של Auramine O, SLAS-S, SLAS-U ומאגר בדיקה. הכן את תערובת המאסטר המכילה את כל רכיבי הבדיקה מלבד המטרה. הוסף מים נטולי נוקלאז לכרך האחרון של חמשת הכרכים האחרונים עד השישי של תערובת המאסטר.
ואז מערבולת וסובב את תערובת המאסטר. הוצא 50 מיקרוליטר לכל צינור דגימה. לאחר מכן, סמן דגימה אחת כחסר יעד ריק ואחת כביקורת חיובית.
הוסף 10 מיקרוליטר של דגימה המכילה מטרה לצינור המכיל את תערובת המאסטר כדי ליצור דגימה של 60 מיקרוליטר. עבור הריק, הוסף 10 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז. לאחר מכן פיפטה 10 מיקרוליטר של DNA סינתטי אוליגונוקלאוטיד המכיל את רצף המטרה לתוך צינור הבקרה החיובי.
מערבבים את כל הדגימות בצנטריפוגה בקצרה באמצעות מיקרו-צנטריפוגה. לאחר מכן דגרו על הצינורות בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 60 דקות. מדוד פלואורסצנטיות ב-540 ננומטר בעת עירור ב-475 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר פלואורסצנטי.
SLAS הותאם כדי להתמקד במקטע ספציפי של הגן NANOGP8. יעד M היה מחמיא לחלוטין לגדיל SLAS-S, בעוד שלמטרה MM היה מיקום נוקלאוטיד ציטוזין 1, 423, מה שהציג אי התאמה עם SLAS-S. עם הוספת היעד המלא M, הקרינה עלתה בהתמדה והתייצבה לאחר 45 עד 50 דקות.
עם זאת, אות ברור היה ניתן לזיהוי תוך 10 דקות עם יחס אות לריק של 10 SLAS הראה אות פלואורסצנטי גבוה עבור מטרות תואמות לחלוטין, אך לא עבור מטרות או ריקים לא תואמים. תפוקת הקרינה גדלה באופן ליניארי עם ריכוז המטרה עד 500 ננו-מולר, מה שמאפשר כימות וקביעת גבולות הזיהוי. דגימות מוגברות PCR הראו רמות שונות של אות כאשר רק דגימה 2 חרגה מערך סף הקרינה של 2.
בהתבסס על עקומת הכיול, ריכוז האמפליקון NANOGP8 במדגם 2 הוערך ב-124+או 13 ננו-מולר. זיהוי הקרינה של אות SLAS היה עקבי הן בספקטרופוטומטר שולחני והן בפלואורומטר נייד. יחס אות לריק מעל 20 נצפה גם חזותית באמצעות אור UV.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
פרוטוקול זה מתאר את הפיתוח של בדיקות היברידיות פלואורסצנטיות לניתוח חומצות גרעין ספציפיות, תוך התמקדות בשימוש של DAP-10-42 כמדווח אותות. הוא מתייחס לאתגרים בזיהוי החלפות נוקליאוטידים בודדות.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- בדיקות היברידיות פלואורסצנטיות
- זיהוי חומצות גרעין
- החלפות נוקליאוטידים בודדות
רקע
- כלי ניתוח ההיברידיה הנוכחיים כוללים בדיקות TaqMan ו-molecular beacon.
- זיהוי מדויק של מטרות חומצות גרעין עדיין מאתגר.
- מערכות CRISPR-Cas הרחיבו את יכולות ניתוח ההיברידיה.
- תוצאות אותות פלואורסצנטיים ללא תוויות חיוניות לניתוח יעיל.
מטרת המחקר
- לתכנן בדיקות היברידיות מפוצלות לשיפור זיהוי חומצות גרעין.
- להבדיל בין מטרות עם החלפות נוקליאוטידים בודדות.
- להבטיח פעילות תאים תוך מתן אותות פלואורסצנטיים מדויקים.
שיטות ששימשו
- תכנון של שתי רצועות אוליגונוקלאוטידים DNA לא משונויות.
- שימוש ב-aptamer פלואורסצנטי DAP-10-42.
- יישום של בדיקות היברידיות מפוצלות בניתוח חומצות גרעין.
- הערכת יעילות תוצאות האותות.
תוצאות עיקריות
- תכנון מוצלח של בדיקות היברידיות מפוצלות.
- הבחנה יעילה של מטרות חומצות גרעין.
- הוכחת תוצאות אותות פלואורסצנטיות ללא תוויות.
- דיוק משופר בזיהוי החלפות נוקליאוטידים בודדות.
מסקנות
- הבדיקות שפותחו משפרות את יכולות זיהוי חומצות גרעין.
- הן מספקות שיטה אמינה לניתוח וריאציות נוקליאוטידיות בודדות.
- גישה זו עשויה לקדם את תחום ניתוח חומצות גרעין.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Sequence-specific nucleic acid analysis using split hybridization probes with DNA fluorescent light-up aptamers (FLAPs) addresses the persistent challenge of detecting single-nucleotide substitutions with high specificity and quantitative confidence. This approach enables label-free, cost-effective, and scalable fluorescence-based readouts, supporting robust target validation and mechanistic de-risking in early discovery and screening workflows. The method's selectivity and quantitative outputs are directly relevant for portfolio triage and risk-adjusted advancement decisions in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting single-nucleotide substitutions with high selectivity.
- Supports functional target validation through quantitative, sequence-specific fluorescence outputs.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing perfectly matched from mismatched nucleic acid targets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, label-free assay systems for downstream screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative fluorescence measurements for assay development.
- Enables rapid, scalable, and portable screening readiness using conventional or handheld fluorescence detection platforms.
Translational & Preclinical Research
- Supports translational biomarker alignment by enabling detection of clinically relevant single-nucleotide variants.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation with quantitative, sequence-specific outputs.
- Reduces biological risk by enabling precise discrimination of target variants in complex samples.
Pipeline & Workflow Integration
This split hybridization probe platform integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis testing, assay development, and translational biomarker validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by enabling sequence-specific nucleic acid detection.
- Screening: Provides reproducible, quantitative fluorescence outputs for reliable compound or target evaluation.
- Analytics: Delivers measurable readouts and statistical discrimination between matched and mismatched targets.
- Translational Research: Aligns with biomarker-driven studies by enabling detection of single-nucleotide variants in disease-relevant samples.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, label-free detection capability adaptable across diverse nucleic acid targets and workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and target validation by enabling single-nucleotide resolution.
- Operational Value: Standardizes and simplifies assay workflows with label-free, scalable detection.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and preclinical programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid probe design and melting temperature analysis.
- Needs access to fluorescence spectrophotometers or portable fluorometers for quantitative readout.
- Demands cross-team standardization of probe synthesis and assay conditions for reproducibility.
- Adaptable to various nucleic acid targets by customizing complementary sequences and probe arms.
- Specificity depends on careful optimization of probe-target duplex stability and assay temperature.
