בדיקת הכלאה מפוצלת המשתמשת באפטמר אור פלואורסצנטי של DNA כמדווח אותות לניתוח חומצות גרעין ספציפיות לרצף

אנו מפתחים סוגים חדשים של בדיקות הכלאה פלואורסצנטיות לניתוח חומצות גרעין ספציפיות לרצף. לאחרונה, כלי ניתוח הכלאה התרחבו עם מבחנים המנצלים את מערכות CRISPR-Cas. נכון לעכשיו, בדיקות הכלאה מתקדמות, כגון TaqMan, ובדיקות משואות מולקולריות, משמשות בעיקר לניתוח מטרות של חומצות גרעין.

זיהוי מדויק של תחליפי נוקלאוטידים בודדים ומטרות חומצות גרעין עדיין מאתגר כמעט. הפרוטוקול שלנו מבטיח את הרמה הנדרשת של פעילות התא תוך מתן קריאת אות פלואורסצנטי ללא תוויות. כדי להתחיל, תכנן את הרצפים של שני גדילי אוליגונוקלאוטידים של DNA לא מותאמים המהווים SLAS.

השתמש בשבר המכיל נוקלאוטידים עבור 6 עד 39 של DAP-10-42. המר גזע 1 המורכב מנוקלאוטידים 1 עד 8 ו-36 עד 42 לגזע 1 ראשוני על ידי הסרת תימין בולט במיקום 5, קיצור הגבעול לארבעה זוגות בסיסים והוספת זוג בסיסים ציטוזין-גואנין טרמינלי. כלול נוקלאוטידים 9 עד 29 בגדיל SLAS אחד ונוקלאוטידים 30 עד 35 בשני.

הרחב את הרצף הסופי של שלושת הראשוניים של השבר עם נוקלאוטידים 9 עד 29 על ידי הוספת דאוקסי GGTCAT. לאחר מכן הרחב את רצף חמשת הטרמינלים הראשוניים של המקטע 30 עד 35 עם דאוקסי TGACC ליצירת גזע זוג שישה בסיסים 2. כעת הרחב את גזע 1 ראשוני בשני הגדילים עם מקשרים דאוקסי TT, ורצפי DNA משלימים למטרה של חומצת הגרעין.

זה מניב את רצפי הגדילים SLAS-U ו-SLAS-S המרכיבים את הבדיקה. הפוך את SLAS-S לחינם לאזור של 7 עד 10 נוקלאוטידים. זה כולל את אתר החלפת הנוקלאוטידים היחיד.

לאחר מכן ודא שזרוע קשירת המטרה של SLAS-U משלימה לשבר נוקלאוטידים של 15 עד 25 הסמוך לאזור SLAS-S. הערך את טמפרטורות ההיתוך של דופלקסי קשירת היעד באמצעות שרת האינטרנט UNAFold. לחץ על הכרטיסייה INAMelt.

עבור אל יישומים ובחר היברידיזציה של התכה של שני מצבים. הזן את הרצפים המקיימים אינטראקציה בסדר של חמישה ראשוניים עד שלושה ראשוניים בתיבות השמאלית והימנית. לאחר מכן התאם את טמפרטורת הבדיקה ל-22 מעלות צלזיוס והזן את ריכוזי הקטיונים החד-ערכיים והדו-ערכיים ליונים של 20 מילי-מולרי ו-25 מילי-מולארי, בהתאמה.

התאם את הריכוזים של רצפי האינטראקציה בתיבה המתאימה. לחץ על שלח וסקור את ערכי שינוי האנרגיה, האנטרופיה, האנטרופיה וטמפרטורת ההיתוך של גיבס עבור הדופלקסים המתאימים. ודא שטמפרטורות ההיתוך עבור מטרות תואמות לחלוטין וזרועות קשירת המטרה של SLAS-S ו-SLAS-U הן מעל טמפרטורת הבדיקה, 22 מעלות צלזיוס.

ודא שהדופלקס בין SLAS-S ליעד לא תואם מניב טמפרטורות התכה מתחת לטמפרטורת הבדיקה כדי לשמור על ספציפיות. במידת הצורך, התאם את אורכי זרועות קשירת המטרה כדי לעמוד בתנאים אלה. השג את גדילי האוליגונוקלאוטידים הסופיים של SLAS-U ו-SLAS-S מספק DNA מסחרי או סנתז אותם בתוך הבית באמצעות סינתיסייזר DNA אוטומטי.

הכן פתרונות מלאי של Auramine O, SLAS-S, SLAS-U ומאגר בדיקה. הכן את תערובת המאסטר המכילה את כל רכיבי הבדיקה מלבד המטרה. הוסף מים נטולי נוקלאז לכרך האחרון של חמשת הכרכים האחרונים עד השישי של תערובת המאסטר.

ואז מערבולת וסובב את תערובת המאסטר. הוצא 50 מיקרוליטר לכל צינור דגימה. לאחר מכן, סמן דגימה אחת כחסר יעד ריק ואחת כביקורת חיובית.

הוסף 10 מיקרוליטר של דגימה המכילה מטרה לצינור המכיל את תערובת המאסטר כדי ליצור דגימה של 60 מיקרוליטר. עבור הריק, הוסף 10 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז. לאחר מכן פיפטה 10 מיקרוליטר של DNA סינתטי אוליגונוקלאוטיד המכיל את רצף המטרה לתוך צינור הבקרה החיובי.

מערבבים את כל הדגימות בצנטריפוגה בקצרה באמצעות מיקרו-צנטריפוגה. לאחר מכן דגרו על הצינורות בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 60 דקות. מדוד פלואורסצנטיות ב-540 ננומטר בעת עירור ב-475 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר פלואורסצנטי.

SLAS הותאם כדי להתמקד במקטע ספציפי של הגן NANOGP8. יעד M היה מחמיא לחלוטין לגדיל SLAS-S, בעוד שלמטרה MM היה מיקום נוקלאוטיד ציטוזין 1, 423, מה שהציג אי התאמה עם SLAS-S. עם הוספת היעד המלא M, הקרינה עלתה בהתמדה והתייצבה לאחר 45 עד 50 דקות.

עם זאת, אות ברור היה ניתן לזיהוי תוך 10 דקות עם יחס אות לריק של 10 SLAS הראה אות פלואורסצנטי גבוה עבור מטרות תואמות לחלוטין, אך לא עבור מטרות או ריקים לא תואמים. תפוקת הקרינה גדלה באופן ליניארי עם ריכוז המטרה עד 500 ננו-מולר, מה שמאפשר כימות וקביעת גבולות הזיהוי. דגימות מוגברות PCR הראו רמות שונות של אות כאשר רק דגימה 2 חרגה מערך סף הקרינה של 2.

בהתבסס על עקומת הכיול, ריכוז האמפליקון NANOGP8 במדגם 2 הוערך ב-124+או 13 ננו-מולר. זיהוי הקרינה של אות SLAS היה עקבי הן בספקטרופוטומטר שולחני והן בפלואורומטר נייד. יחס אות לריק מעל 20 נצפה גם חזותית באמצעות אור UV.