מסגרת הדמיה רב-מודאלית לקידום פנוטיפ של תאי סרטן שד חיים ללא תווית

כעת הפרוטוקול שלנו, אנו מציגים הדמיה מולטי-מודאלית באמצעות מיקרוספקטרוסקופיה קונפוקלית של ראמאן ומיקרוסקופ פאזה טומוגרפית לפנוטיפ מורפוכימי מהיר ובלתי מוטה של תאי סרטן שד אנושיים בסביבתם הפיזיולוגית הטבעית. שילוב מיקרוספקטרוסקופיה של רמאן ומיקרוסקופ פאזה טומוגרפיה מאפשר הדמיה ללא תוויות בתנאים פיזיולוגיים, מספק מידע ביוכימי ומורפולוגי על תאים ומתייחס למגבלות של שיטות הפרעה קונבנציונליות, כגון תיוג פלואורסצנטי או קיבוע כימי. התוצאות שלנו מדגימות פוטנציאל גבוה של יישום גישה מולטי-מודאלית במתן פנוטיפ מורפוכימי של תאי סרטן השד. יתר על כן, הרבגוניות, יכולת השחזור והלא פולשניות שלו הפכו לכלי מבטיח למגוון רחב של יישומים ביו-רפואיים, החל ממחקרים בסיסיים בביולוגיה של התא ועד לאבחון.

אנו שואפים ליצור אטלס של סמנים ביולוגיים אופטיים לבקרת איכות עוברית לא פולשנית, זיהוי הזדקנות תאית וסינון תרופות במודלים אורגנואידים כדי לקדם רפואה רגנרטיבית וחקר מחלות.

[מדריך] כדי להתחיל, הנח את דגימת תאי סרטן השד האנושיים MDA-MB-231 באינקובטור על הבמה. הוסף מים למטרת הטבילה במים. הפעל את מזין הטבילה האוטומטי במים כדי לספק מים לעדשת המטרה. בדוק באופן קבוע את מפלס המים כדי למנוע אידוי ולהבטיח תנאי הדמיה עקביים לאורך כל המדידות. כעת, הפעל את לייזר המשאבה והתאם את הפלט שלו כדי להשיג הספק לייזר של 75 מילי-וואט במישור הדגימה. פתח את תוכנת בקרת המיקרוסקופ Micro-Manager. בהגדרות התצורה, בחר BF ולחץ על שידור חי בצד שמאל של חלון התוכנה. בחר את התא הבודד הרצוי ולאחר מכן לחץ על עצור כדי לסיים את הדמיית השדה הבהיר. פתח את תוכנת בקרת מצלמת ה-CCD. בהגדרת הניסוי, הגדר את זמן החשיפה ל-1.5 שניות. לחץ על הפעל בסרגל הכלים של הניסוי והפעל את קרן הלייזר. לאחר מכן, כוונן את מיקום Z כדי למקסם את ספירת האותות באזור טביעת האצבע מ-600 ל-1,800 סנטימטרים הפוכים, ולאחר מכן כבה את הלייזר. לחץ על עצור בסרגל הכלים של הניסוי וצא מהתוכנה. התחל את תהליך רכישת הנתונים באמצעות סקריפט MATLAB, המנהל אוטומטית ערוצי Raman במדידות רב מימדיות ושומר את הנתונים. הגדר את שדה הראייה לריבוע של 50 על 50 מיקרומטר ברזולוציה של 40 על 40 פיקסלים, כאשר כל פיקסל מכסה 1.25 על 1.25 מיקרומטר מרובע. הגדר את זמן החשיפה עבור כל ספקטרום Raman ל-1.5 שניות והפעל את סקריפט MATLAB. לעיבוד שלאחר מפות היפרספקטרליות של ראמאן, הפעל את הכלי מבוסס האינטרנט RamApp. ייבא את הנתונים ההיפרספקטרליים על ידי לחיצה על חדש בכרטיסייה הניתוחים שלי והעלה את קובץ ה- .mat המכיל את משתני הנתונים המרחביים והספקטרליים, יחד עם משתנה ציר X. כדי לחתוך את הספקטרום, בתפריט 'חיתוך וסיבוב', בחרו 'חיתוך ספקטרלי'. הגדר את הגבולות התחתונים והעליונים של אזור היסט ראמאן כ-600 ו-1,800 סנטימטרים הפוכים בהתאמה. כדי לתקן קרניים קוסמיות, עבור אל דה-נוזינג, לחץ על despike, בחר ציון Z כשיטה והגדר את הסף לשמונה. סמן את האפשרויות השתמש בהפרש הראשון ותקן קוצים ולאחר מכן לחץ על הפעל כדי להחיל את התיקון. כדי להסיר רעש מהמפות, לחץ/י על ״מפה חלקה״, בחר/י את המסנן החציוני, הגדר/י את גודל הריבוע לשלושה פיקסלים ולאחר מכן לחץ/י על ״הפעל״. להחלקת הספקטרום של כל פיקסל, בחרו במסנן Savistky-Golay. הגדר את אורך חלון המסנן לשבע ואת הסדר הפולינומי, ולאחר מכן לחץ על הפעל. כדי להפחית את אות הרקע הממוצע, פתח את הסרת המצע האופטי ולחץ על זיהוי מצע. הגדר k-means כשיטה עם שני אשכולות. לאחר מכן לחץ על אפשרויות מתקדמות. בחר/י ״ניקוי מורפולוגי״ כדי להסיר כתמים קטנים מהחזית ולאחר מכן לחץ/י על ״הפעל״. כדי להסיר את אות הרקע הממוצע, לחץ על הסר מצע, ולאחר מכן בחר ממוצע גלובלי או ממוצע של שיטת 95% הערכים המרכזית ולחץ על הפעל. כדי לתקן את הקרינה הבסיסית, פתח את לוח הבסיס, לחץ על קו הבסיס הנכון, בחר PLS חלקות אדפטיבית, ואז הגדר למבדה ל-5 מיליון ולחץ על הפעלה. לנורמליזציה של כל מפה היפרספקטרלית של ראמאן, עבור אל שונות, בחר נורמליזציה, בחר שיטת פרובניוס ולחץ על הפעל. כדי ליצור תמונת צבע כוזב המציגה התפלגות תת-תאית, בחלונית תמונות, לחץ על סמל התפריט הפתוח תחת תמונת עוצמה, ולאחר מכן לחץ על ערוך תמונה. בחלונית העריכה, בחר פס יחיד והגדר את הטווח הספקטרלי. כעת, בחרו צבע כפול במפת הצבעים, ולאחר מכן הגדירו את הצבע, סף העוצמה והאטימות לפני שתלחצו על אישור. להורדה של ספקטרום נקודתי בודד, בחר פיקסל מעניין, ולאחר מכן בלוח המקרא הספקטרלי, לחץ על הורד ספקטרום. לבסוף, כדי לייצא ספקטרום חזית ומצע, נווט אל מקרא ספקטרלי, ולאחר מכן לחץ על הורד ספקטרום עבור קטעי חזית ומצע. הנח טיפת מים מזוקקים על עדשת האובייקט של המיקרוסקופ. מקם את הדגימה על שלב התרגום של המיקרוסקופ, ולאחר מכן התאם את מיקום הדגימה כדי ליישר אותה עם עדשת האובייקט. הפעל את המיקרוסקופ והפעל את תוכנת ההדמיה. לחץ על סמל המיקרוסקופ בסרגל הכלים. לאחר האתחול, לחץ על תצורה, בחר תא חי בלוח העבודה ו-PBS כמדיום. לאחר מכן, גש ללשונית הכיול בלוח הבקרה של תוכנת ההדמיה. הגדר את המיקומים הציריים של עדשות האובייקט והמעבה על ידי בחירת מיקוד ומשטח בהתאמה. כעת, לחץ על מצב סריקה כדי לכוונן את העדשות באופן ידני ולהבטיח שדפוסי התאורה ממורכזים וכמעט סטטיים. בחר במצב רגיל ולאחר מכן התאם את שלב התרגום כדי להביא את התא לשדה הראייה ולהתמקד בדגימה. התאם את שלב התרגום כדי לאתר אזור ללא תאים. בחר כיול כדי ללכוד הולוגרמות דו-ממדיות מרובות בזוויות תאורה משתנות. התאם את שלב התרגום למרכז התא, ולאחר מכן נווט ללשונית הרכישה ובחר תמונת מצב תלת מימדית כדי ללכוד את הטומוגרמה של התא. כדי להציג באופן חזותי את הטומוגרמות ההולוגרפיות, בחר את הנתונים בלוח הניווט של הנתונים, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ולחץ על פתח. בלוח מנהל הנתונים, לחץ על טומוגרפיה של RI. בלוח התצוגה החזותית של אמצעי האחסון, בחר RI וצייר ארבע תיבות צבע מלבניות בתוך בד הציור של RI. קבעו את ערכי המינימום והמקסימום של טווח ה- RI לכל תיבת צבע, ולאחר מכן שייכו אטימות וצבע לכל תיבה. לחץ על שמור כדי לאחסן את טווחי ה- RI ותיבות הצבע שהוגדרו. כדי להשיג מתארים כמותיים של מורפולוגיה של תאים, השתמש בממשק הניתוח. בחר ידני בלוח הפילוח ולאחר מכן הגדר 1.3450 כספיף ה-RI ולחץ על החל. לחץ על שמור כדי לשמור את האינדקסים המורפולוגיים המחושבים. מיפוי ספקטרלי של ראמאן חשף את ההתפלגות המרחבית של ציטופלזמה, גרעין, פנילאלנין ושומנים בתוך תאי MDA-MB-231 בודדים. פסגות ספקטרליות מובהקות של ראמאן המתאימות לציטופלזמה, גרעין, פנילאלנין ושומנים אושרו באזור טביעת האצבע בין 600 ל-1,800 סנטימטרים הפוכים. מפות חום של מקדם שבירה של תאים בודדים חשפו את ההתפלגות הפנימית של רכיבים תת-תאיים במישור XY הצירי, מישור ה-YZ הסגיטלי ומישורי ה-XZ העטרתיים. שחזור טומוגרפי תלת מימדי זיהה אזורים של מקדם שבירה נפחי המתאימים לתשתיות פנימיות. מדידות מורפולוגיות כמותיות של תא MDA-MB-231 בודד הראו מתארים שונים של מורפולוגיה של תאים, עם נפח כולל של 4024.189 מיקרומטר מעוקב ושטח פנים של 2383.707 מיקרומטר רבוע, עם מקדם שבירה ממוצע של 1.356.