תיוג hESCs ו hMSCs עם ברזל אוקסיד חלקיקים עבור פולשני של מעקב vivo עם MR Imaging

להערכת טיפולים בתאי גזע חדש חשוב הלא פולשני המסלול התאים מוזרקים in vivo. סרט הווידאו הזה יראה לכם כיצד לתייג אדם בתאי גזע mesenchymal ו עובריים עם סוכני תחמוצת ברזל מבוסס בניגוד in vivo עבור הבאים MR הדמיה in vivo.

ברוכים הבאים למעבדה של ד"ר הייקו דאל לינק. אנו רוצים להודות למכון לרפואה רגנרטיבית בקליפורניה על מימון הפרויקט הזה להערכת טיפולים חדשים בתאי גזע. חשוב לעקוב באופן לא פולשני אחר התאים המוזרקים in vivo.

זה אפשרי על ידי תיוג התאים במבחנה עם חומרי ניגוד ספציפיים או רב תכליתיים להדמיית MR או הדמיה אופטית. סרטון זה יראה לך כיצד לתייג תאי גזע מזנכימליים אנושיים ותאי גזע עובריים אנושיים להדמיה עוקבת in vivo. היי, אני טוביאס הנינג מקבוצת המחקר של סוכני ניגוד במרכז להדמיה מולקולרית ותפקודית במחלקה לרדיולוגיה באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו.

היום אני הולך להראות לכם נהלים לתיוג במבחנה של תאי גזע מזנכימליים אנושיים עם פריק, קרון, ושל תאי גזע עובריים אנושיים עם תחמוצות פם. טכניקה זו שימושית על מנת למקם תאים מוזרקים in vivo או לקבל מידע על מצבם התפקודי. ההליכים לתיוג תאים עם חומר מודע MRI משתנים עבור תאי גזע עובריים ומזנכימליים, אך שתי הטכניקות כוללות את השלבים הבאים, הכנת תרבית התאים המהווה ציפוי של תאים כהיצמדות לתרביות תאים הכנת תיוג, תיוג מדיה של התאים על ידי דגירה פשוטה טריפסין של תאי גזע ושטיפת הערכת חומר מודע חופשי של יעילות התיוג וכדאיות התא.

אז בואו נתחיל ונסמן כמה תאים. עכשיו בואו נתחיל בתיוג תאי גזע מזנכימליים עם תיאו קרברול. ראשית, אראה את הטכניקה לתיוג תאי גזע מזנכימליים אנושיים עם חומר ניגוד מבוסס תיאו קרון ותחמוצת ברזל להדמיית MR.

כדי להתחיל, אנו לוחים את התאים 18 עד 24 שעות לפני הליך התיוג בצלוחיות T 75 במפגש של 80%אחרת, אם אתה משתמש בצלחת תרבית אחרת השווה לכ-10,000 תאים לסנטימטר רבוע למחרת, אנו מתחילים בהכנת אמצעי התיוג על ידי הוספת 30 מיקרוליטר של מילואים לשמונה מיליליטר של מדיה ללא סרום. זה יסמן T 75 FLA אחד בשטף של 80% ומתאים לריכוז של מאה מיקרוגרם ברזל למיליליטר מדיה. עכשיו אנחנו מורידים את אמצעי התרבית ושוטפים את התאים פעם אחת עם PBS או מדיה ללא סרום.

אנו עושים זאת כדי להיפטר משאריות חלבוני סרום ומרכיבים אחרים של המדיה שעלולים לקשור את חומרי הניגוד ולהשפיע על יעילות התיוג. הוסף את אמצעי התיוג לבקבוק והחזיר את הבקבוק לחממה. לאחר שעתיים, הוסף שני מ"ל FCS כך שיושג ריכוז סופי של 20% FCS.

אנו עושים זאת כדי להבטיח שהתאים לא יקבלו שום גירוי להתמיין שהם מתים לגדול בסביבתם המוכרת. כעת אנו דוגרים על התאים למשך 18 שעות. למחרת אנו שוטפים את התאים עם PBS ואז מסדרים אותם על פי פרוטוקולי תרבית סטנדרטיים על מנת להיפטר מחומר ניגוד חופשי.

לאחר הכנסת טריפס, מתלה התא נשטף שלוש פעמים על ידי צנטריפוגה ב-400 RCF למשך חמש דקות, והשעיית ראוס ב-PBS. זהו. ניתן להשעות מחדש את התא הסופי P והוא מוכן לניסויים נוספים.

אנו סופרים את התאים כעת מכיוון שאולי איבדנו חלק במהלך שלבי הכביסה הקודמים. אנו מבצעים גם בדיקות כדאיות בשלב זה באמצעות בדיקת אי הכללה כחולה של טריפין ולוקחים כמה דגימות לניתוח ספקטרומטרי כדי למדוד את יעילות התיוג. עכשיו הרשו לי להראות לכם כיצד לתייג תאי גזע עובריים אנושיים עם תחמוצות פם.

כדי להתחיל, אנו לוחים את תאי הגזע העובריים האנושיים בכלים של 10 סנטימטרים. כרגיל, כלים אלה מקודדים מראש בג'לטין ועליהם תאי הזנה מוקרנים. אתה יכול להשתמש בפרוטוקול זה גם עבור תרביות ללא מזין.

אנו מאפשרים לתאי הגזע העובריים האנושיים להתחבר ולגדול במשך כשלושה עד ארבעה ימים כך שהם יוצרים מושבות בגודל בינוני. במהלך הזמן הזה, אנו מוודאים שהמושבות לא יגדלו יותר מדי מכיוון שקשה יותר לפרק מושבות גדולות יותר. מאוחר יותר, תאים מובחנים יכולים לזהם את התרביות הללו.

לכן, בהתאם לניקיון המושבות, ייתכן שנצטרך להיפטר מתרבויות מובחנות על ידי ניתוח. כעת אנו מכינים את אמצעי התיוג המורכב מתחמוצות משפט בריכוז של מאה מיקרוגרם ברזל למיליליטר ומדיה מלאה של תאי גזע עובריים אנושיים. לשם כך אנו מערבבים 89 מיקרוליטר, תחמוצות פם ו -10 מיליליטר של מצע גידול מלא.

באשר לתאי גזע מזנכימליים, אנו שוטפים את הכלים פעם אחת עם מדיה מלאה כדי להיפטר מתאים מתים או פסולת. לאחר מכן אנו מוסיפים 10 מיליליטר של אמצעי תיוג למנה ודוגרים על התאים למשך ארבע שעות. כעת התיוג הושלם.

בשלב הבא, אנו צריכים לשטוף את התאים ולקבל תרחיף תא בודד. לשימוש נוסף לשם כך אנו שוטפים תחילה את המנה עם PBS. כעת אנו מחליפים את ה-PBS בחמישה מיליליטר של 0.25% טריפסין ודוגרים במשך חמש דקות באינקובטור או עד שהתאים מתנתקים.

זה עוזר להקיש על הצלחת לעתים קרובות התאים התנתקו כעת. זכור שאם המנה הכילה מושבות גדולות יותר, ייתכן שנותרו כמה גושים כדי להיפטר מהגושים הללו. אנו מערבבים היטב את כל המתלה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה, בעזרת פיפטה סרולוגית, ואז נותנים לו לשבת עוד שתי דקות.

בטריפסין. איננו משתמשים בפיפטה אפנדורף מכיוון שפיפטינג חוזר ונשנה של התאים דרך הקצה הדק יכול לשבור את קרומי התאים אם הכל עבד כמו שצריך. יש לנו עכשיו תרחיף של תא בודד שמעורבב עם הרבה פסולת שמקורה בג'לטין המצפה את מטריצת תאי הגזע העובריים ותאים מתים.

כעת אנו יכולים להיפטר מגושים או קומפלקסים שנותרו על ידי העברת התאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר. כעת עלינו לבודד את תאי הגזע העובריים האנושיים מתאי ההזנה המוקרנים. ניתן לעשות זאת ביעילות על ידי ציפוי מתלה התאים על צלחת מצופה ג'לטין.

אם לא נבצע מניפולציות על הצלחת, כל התאים ישקעו למטה, אולם המזינים יתחברו מהר יותר מתאי הגזע העובריים האנושיים. כך שאם נסיר את ה-SUP natin לאחר 45 דקות, הוא אמור להכיל בעיקר תאי גזע עובריים אנושיים, בעוד שהמאכילים צריכים להיות מחוברים בעיקר לצלחת. בדרך זו, אנו משיגים תרחיף תא בודד של תאי גזע עובריים אנושיים המסומנים מגנטית שיכולים לשמש לניסויים נוספים כמו בפרוטוקול הקודם.

בשלב זה, עליך לספור את התאים ולקחת דגימות להערכת כדאיות ומדידת יעילות התיוג. אז זה מסיים את הפרוטוקולים שרציתי להראות לכם היום. עכשיו בואו נסתכל כיצד אנו יכולים לעקוב אחר תאי גזע מסומנים in vivo.

שקופית זו מציגה תאי גזע עם תווית OC Carone. לאחר שהם הוזרקו למוח של עכבר, השהינו 20,000 תאים בנפח של 75 ננוליטר והזרקנו אותם לאזור התת-חדר. תחמוצת הברזל בתאים המושתלים גורמת לחפץ רגישות שניתן לראות ב-MR. תמונות.

זה עתה הראינו לכם כיצד לתייג תאי גזע עובריים ומזנכימליים. לחומרים במבחנה עם Mr.Contrast העוקבים אחר תאי גזע מזנכימליים ועובריים in vivo יש פוטנציאל עצום להערכת טיפולים חדשים בתאי גזע. אז זהו.

תודה על הצפייה ובהצלחה עם תיוג התא שלך.