Name: ב Vivo ביוטינילציה של קרבה למחקרי אינטראקציה בין חלבונים ב-Paramecium tetraurelia (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: למד שיטת ביוטינילציה חיה ב-Paramecium tetraurelia באמצעות ליגאזת turboID לחקר אינטראקציות חלבוניות. השיטה מאפשרת עשרת חלבונים מסומנים וניתנת להתאמה לגנים שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Stefanov, B. -A., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+mechanisms+of+eukaryotic+RNA-guided+programmed+DNA+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Functions and mechanisms of eukaryotic RNA-guided programmed DNA elimination.</a> Biochem Soc Trans. 53 (2), 473-485 (2025).</li>
<li>Swart, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+genetic+and+epigenetic+control+of+programmed+DNA+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of genetic and epigenetic control of programmed DNA deletion.</a> Nucleic Acids Res. 42 (14), 8970-8983 (2014).</li>
<li>Witzany, G. The Roles of transposable elements in transgenerational inheritance and genome evolution. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStefanov%2C+B-A+%22Epigenetics+in+Biological+Communication.+Witzany%2C+G%22">Epigenetics in Biological Communication. Witzany, G</a>. , Springer Cham. 369-385 (2024).</li>
<li>Dubois, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+invasion+of+the+paramecium+germline+genome+countered+by+a+domesticated+piggybac+transposase+and+the+NHEJ+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Evol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transposon invasion of the paramecium germline genome countered by a domesticated piggybac transposase and the NHEJ pathway.</a> Int J Evol Biol. 2012, 436196(2012).</li>
<li>Gruchota, J., Denby Wilkes, C., Arnaiz, O., Sperling, L., Nowak, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+meiosis-specific+Spt5+homolog+involved+in+non-coding+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A meiosis-specific Spt5 homolog involved in non-coding transcription.</a> Nucleic Acids Res. 45 (8), 4722-4732 (2017).</li>
<li>Sandoval, P. Y., Swart, E. C., Arambasic, M., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversification+of+Dicer-like+proteins+and+small+RNAs+required+for+genome+sculpting%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional diversification of Dicer-like proteins and small RNAs required for genome sculpting.</a> Dev Cell. 28 (2), 174-188 (2014).</li>
<li>Furrer, D. I., Swart, E. C., Kraft, M. F., Sandoval, P. Y., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+sets+of+piwi+proteins+are+involved+in+distinct+sRNA+pathways+leading+to+elimination+of+germline-specific+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Two sets of piwi proteins are involved in distinct sRNA pathways leading to elimination of germline-specific DNA.</a> Cell Rep. 20 (2), 505-520 (2017).</li>
<li>Lepère, G., Bétermier, M., Meyer, E., Duharcourt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+noncoding+transcripts+antagonize+the+targeting+of+DNA+elimination+by+scanRNAs+in+Paramecium+tetraurelia%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Maternal noncoding transcripts antagonize the targeting of DNA elimination by scanRNAs in Paramecium tetraurelia.</a> Genes Dev. 22 (11), 1501-1512 (2008).</li>
<li>Garnier, O., Serrano, V., Duharcourt, S., Meyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-mediated+programming+of+developmental+genome+rearrangements+in+Paramecium+tetraurelia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA-mediated programming of developmental genome rearrangements in Paramecium tetraurelia.</a> Mol Cell Biol. 24 (17), 7370-7379 (2004).</li>
<li>Khanduja, J. S., Calvo, I. A., Joh, R. I., Hill, I. T., Motamedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+noncoding+RNAs+and+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear noncoding RNAs and genome stability.</a> Mol Cell. 63 (1), 7-20 (2016).</li>
<li>Yao, M. -C., Chao, J. -L., Cheng, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+genome+rearrangements+in+Tetrahymena%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Programmed genome rearrangements in Tetrahymena.</a> Microbiol Spectr. 2 (6), (2014).</li>
<li>Nowacki, M., Zagorski-Ostoja, W., Meyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nowa1p+and+Nowa2p%3A+Novel+putative+RNA+binding+proteins+involved+in+trans-nuclear+crosstalk+in+Paramecium+tetraurelia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nowa1p and Nowa2p: Novel putative RNA binding proteins involved in trans-nuclear crosstalk in Paramecium tetraurelia.</a> Curr Biol. 15 (18), 1616-1628 (2005).</li>
<li>Drews, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+piwis+with+Ago-like+functions+silence+somatic+genes+at+the+chromatin+level%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Two piwis with Ago-like functions silence somatic genes at the chromatin level.</a> RNA Biol. 18 (sup2), 757-769 (2021).</li>
<li>Singh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISWI1+complex+proteins+facilitate+developmental+genome+editing+in+Paramecium%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ISWI1 complex proteins facilitate developmental genome editing in Paramecium.</a> Genome Res. 35 (1), 93-108 (2025).</li>
<li>Bernier, S. C., Cantin, L., Salesse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+the+expression%2C+solubility%2C+and+purification+of+a+passenger+protein+in+fusion+with+different+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of the expression, solubility, and purification of a passenger protein in fusion with different tags.</a> Protein Expr Purif. 152, 92-106 (2018).</li>
<li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms+with+TurboID%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID.</a> Nat Biotechnol. 36 (9), 880-887 (2018).</li>
<li>Beisson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+clonal+Paramecium+tetraurelia+cell+lines+of+controlled+age+through+daily+reisolation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Maintaining clonal Paramecium tetraurelia cell lines of controlled age through daily reisolation.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (1), pdb.prot5361(2010).</li>
<li>Berger, J. D., Rahemtullah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commitment+to+autogamy+in+Paramecium+blocks+mating+reactivity%3A+implications+for+regulation+of+the+sexual+pathway+and+the+breeding+system%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Commitment to autogamy in Paramecium blocks mating reactivity: implications for regulation of the sexual pathway and the breeding system.</a> Exp Cell Res. 187 (1), 126-133 (1990).</li>
<li>Stefanov, B. -A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+protein+thermometer+enables+precise+electrothermal+control+of+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded protein thermometer enables precise electrothermal control of transgene expression.</a> Adv Sci (Weinh). 8 (21), e2101813(2021).</li>
<li>Shin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+proximity+labeling+with+enhanced+direct+identification+of+biotinylation+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Super-resolution proximity labeling with enhanced direct identification of biotinylation sites.</a> Commun Biol. 7 (1), 554(2024).</li>
<li>Leffers, K. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+natural+and+recombinant+prion+protein+into+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Assembly of natural and recombinant prion protein into fibrils.</a> Biol Chem. 386 (6), 569-580 (2005).</li>
<li>Stefanov, B. -A., Ajuh, E., Allen, S., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+release+factor+1+from+Euplotes+promotes+frameshifting+at+premature+stop+codons+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic release factor 1 from Euplotes promotes frameshifting at premature stop codons in human cells.</a> iScience. 27 (4), 109413(2024).</li>
<li>Stefanov, B. -A., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarker-driven+feedback+control+of+synthetic+biology+systems+for+next-generation+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biomarker-driven feedback control of synthetic biology systems for next-generation personalized medicine.</a> Front Bioeng Biotechnol. 10, 986210(2022).</li>
<li>Stefanov, B. -A., Mansouri, M., Charpin-El Hamri, G. -, Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sunlight-Controllable+Biopharmaceutical+Production+for+Remote+Emergency+Supply+of+Directly+Injectable+Therapeutic+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Sunlight-Controllable Biopharmaceutical Production for Remote Emergency Supply of Directly Injectable Therapeutic Proteins.</a> Small. 18 (41), e2202566(2022).</li>
<li>Rzeszutek, I., Maurer-Alcalá, X. X., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+genome+rearrangements+in+ciliates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Programmed genome rearrangements in ciliates.</a> Cell Mol Life Sci. 77 (22), 4615-4629 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>מיקרוסקופ Axiovert 40 CFL (עדשות 10x, 40x)</td><td>צייס</td><td>נה</td><td></td></tr><tr><td>ב-סיטוסטרול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>567152</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>א9647</td><td></td></tr><tr><td>שמן סלטראם</td><td>אפנדורף</td><td>נה</td><td></td></tr><tr><td>רצף DNA 3xHA-turboID אופטימלי של קודון</td><td>טוויסט מדעי הביולוגיה</td><td>נה</td><td>GCTAGCTATCCATAcGAaGTTC CTGATTATGCTTATCTCTACGAT GTTCCTGATTATGCTTATCTAT GATGTACCTGATTACGCTGGATC AAAAGATAATACTGTACCTCTTAA ATTACGCTTTATTAGCTAATGG TGAATTTCATTCTGGTGAACAACAC TTGGTGAAACTTTAGGTATGTCA AGAGCTGCTATTAATAAACACATT CAAACTTTAAGAGATTGGGGT TGATGTTTTTACTGTCCCTGGTAA AGGATATTCACTTCCTGAACCCAT TCCTTTATTAAATGCTAAACAAAT TTTAGGTCAATTAGATGGAGGTT CTGTTGCTGTTTTACCTGTTGTT GACTCAACTAATCAATTTATTAG ATAGAATTGGTGAATTAAAGTCAG GTGATGCTTGTATTGCTGAATACC AACAAGCTGGTAGTAGAGGTTCAAGA GGTAGAAAATGGTTTTCTCCTTTTTTTTTT GGTGCTAATTTATACCTTTCCATGT TCTGGAGACTTAAAAGAGGTCCCG CAGCTATTGGATTAGGTCCTCTCAT TGGTATTGTTATGGCTGAAGCTCT TAGAAAATTAGGTGCTGCTAAGGT TAGAGTTAAATGGCCTAATGATTTA TATCTTCAAGATAGAAAACTTGCT GGTATACTTGTTGAATTAGCTGGT ATTACTGGTGATGCCGCTCAAATT GTTATCGGTGCTGGTGTATTAATGTTG CTATGAGAAGAGTTGAAGAATCAG TTGTTAATCAAGGTTGGATTACTCT > TCAAGAAGCTGGTATAAATCTTGAT AGAAACACTTTAGCTGCTACTCTCA TTAGAGAACTTAGTAGTAGGCTGCTAGA ATTATTTGAACAAGAAGGTTTGGCT CCTTATCTTCCTAGATGGGAAAAAAT TAGATAATTTCATTAATAGACCTGTTA AATTAATTATTGGTGATAAAGAAATTT TCGGTATTTCAAGAGGTATAGATAAAC AAGGAGCTCTTTTATTAGAACAAGATG GTGTTATCAAACCATGGATGGGGTTG GAAATTTCATTGAGATCAGCTGAAAAa GAAATGA</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>AAA151610B</td><td></td></tr><tr><td>טיפים למיקרו-מעמיס epT.I.P.S.</td><td>אפנדורף</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>גרוג כימי</td><td>1009832500</td><td></td></tr><tr><td>פמטו-ג'ט 4i</td><td>אפנדורף</td><td>נה</td><td></td></tr><tr><td>פמטוטיפ II</td><td>קליבר סיינטיפיק</td><td>5242957000</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פורמלדהיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>AppliChem</td><td>10021259</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן IgG נגד ארנב עיזים, Alexa Fluor 568</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>א-11011</td><td></td></tr><tr><td>HA-tag (C29F4) ארנב mAB</td><td>מערכות תאים</td><td>3724</td><td></td></tr><tr><td>InjectMan NI 2</td><td>אפנדורף</td><td>נה</td><td></td></tr><tr><td>בינוני בהיר</td><td>נה</td><td>נה</td><td>תמיסת אבקת עשב חיטה 0.2x ב-2.5 מ"מ Na2HPO4</td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>M8691</td><td></td></tr><tr><td>N2HPO4</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>פנול-כלורופורם-איזואמילאלקוהול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>77617</td><td></td></tr><tr><td>מי מלח עם זרחן&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>10722497</td><td></td></tr><tr><td>ערכת פלסמיד פלוס midiprep</td><td>קיאג'נה</td><td>12945</td><td></td></tr><tr><td>מדיום עשיר</td><td>נה</td><td>נה</td><td>1x תמיסת אבקת עשב חיטה ב-2.5 מ"מ Na2HPO4</td></tr><tr><td>סטרפטווידין-FITC</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>11-4317-87</td><td></td></tr><tr><td>מסנן צנטריפוגלי Ultrafree-MC GV&nbsp;</td><td>EMD מיליפור</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>פתרון כביסה</td><td>נה</td><td>נה</td><td>0.1% BSA במי וולביק&nbsp;</td></tr><tr><td>תמיסת אבקת עשב חיטה</td><td>פיינס אינטרנשיונל</td><td>נה</td><td>הכן כמלאי פי 20 מהאבקה כפי שתואר קודם לכן (0.5 גרם/10 מ"ל)</td></tr><tr><td>סטרפטווידין-HRP</td><td>אילן אילן</td><td>אילן אלכסנדר</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי מגנאטי מצופים סטרפטווידין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>LSKMAGT02</td><td></td></tr><tr><td>מאגר ליזיס למשיכה</td><td>נה</td><td>נה</td><td>50 מ"מ טריס pH 8; 150 מ"מ NaCl; 0.5% נתרן דאוקסיכולאט; 1% טריטון X-100; 5 מ"מ MgCl2; 2x מעכב פרוטאז cOmplete (Roche); &nbsp;</td></tr><tr><td>מאגר כביסה 1 למשיכה</td><td>נה</td><td>נה</td><td>50 מ"מ טריס pH 8; 150 מ"מ NaCl; 0.5% נתרן דאוקסיכולאט; 1% טריטון X-100; 5 מ"מ MgCl2;</td></tr><tr><td>מאגר כביסה 2 למשיכה</td><td>נה</td><td>נה</td><td>10 מ"מ טריס pH 7.4; 150 מ"מ NaCl; 0.01% NP40; 1 מ"מ MgCl2</td></tr><tr><td>מאגר כביסה 3 למשיכה</td><td>נה</td><td>נה</td><td>10 מ"מ טריס pH 7.4; 150 מ"מ NaCl;</td></tr></tbody></table>

ב vivo ביוטינילציה של קרבה למחקרי אינטראקציה בין חלבונים ב-paramecium tetraurelia

In Vivo Proximity Biotinylation for Protein Interaction Studies in Paramecium tetraurelia

הפרוטוקול שלנו מתאר שיטה פשוטה להכנסת שינוי ביוטין קוולנטי לחלבונים בקרבת חלבון מטרה ב Paramecium (איור 1א). לאחר מכן ניתן להעשיר את החלבונים הביוטיניים הללו באמצעות משיכת סטרפטווידין ולזהות אותם באמצעות ספקטרומטריית מסה20. כדי להדגים מקרה שימוש מעשי של השיטה, יישמנו את הפרוטוקול על חלבון Nowa1. חלבון זה חיוני לתהליך הסידור מחדש הגנומי ויש לו שינויים דינמיים בלוקליזציה שלו12. בשלבים המוקדמים הוא נשאר בגרעין הסומטי הישן ובשברים, אך מאוחר יותר הוא ממוקם בגרעין המתפתח החדש. יש לציין כי ניסיונותינו הקודמים להעשרה בתיווך תג של חלבוני האינטראקציה Nowa1 לא צלחו (תוצאות שלא פורסמו). סביר להניח שהסיבה לכך היא החזרות המורכבות הנושאות דמיון לחלבון הפריון PrP27 שעלולות לגרום לצבירה עצמית בתנאים לא אופטימליים במהלך הליך המשיכה21. ה-PCR הגביר את אזור הקידוד Nowa1 יחד עם האזור הלא מקודד במעלה הזרם המכיל את המקדם. לאחר מכן המוצר הוכנס למסגרת עם רצף קידוד turboID מותאם לקודון (איור 1ב). כדי למנוע השתקה הנגרמת על ידי טרנסגנים הנגרמת על ידי הזרקת DNA מעגלי פנימה Parameciumהווקטור עבר ליניאריזציה לפני ההזרקה., לאחר מכן ה-DNA הליניארי והמטוהר הוזרק לתוך הגרעין הסומטי (MAC) כמתואר בפרוטוקול זה. טיפה מפוזרת המוגבלת בתוך האזור הכהה יותר של הגרעין הסומטי נראתה בחלק מההזרקות המוצלחות (איור 1ג). ההזרקה המוצלחת והגברת ה-DNA על ידי התאים במהלך חלוקת התאים אומתו לאחר מכן על ידי PCR. כצפוי, 40-50% מהתאים היו חיוביים ל-DNA המוזרק של מבנה Nowa1 (גודל מוצר צפוי 685 bp) (איור 2). השלב הבא היה לאמת את נוכחות החלבון המקודד על ידי ה-DNA המוזרק. מכיוון שהווקטור הנמען מכיל את רצף ה-turboID שמשני צדיו תג HA משולש, השתמשנו בצביעה אימונופלואורסצנטית כדי לזהות את התג. זה איפשר לנו לוודא אם התאים המוזרקים מבטאים את חלבון ההיתוך ואם הוא ממוקם כראוי. השתמשנו בתאים בשלב מאוחר שהראו לוקליזציה של חלבון ההיתוך בשני הגרעינים המתפתחים החדשים, כפי שנצפה בעבר עבור חלבון Nowa1 מסוג פרא12. קווי התאים הבודדים שהוזרקו הראו רמות שונות של חלבון האיחוי (איור 3). רמת ביטוי נמוכה יותר יכולה להועיל ליישומים שבהם רצוי רקע מופחת, אך במקרה זה, בחרנו באות מקסימלי והמשכנו עם שיבוט 2, שהראה את הביטוי הגבוה ביותר. לאחר מכן אספנו דגימות בשלבי התפתחות שונים כדי לעקוב אחר הלוקליזציה של חלבון ההיתוך. החלבון היה ממוקם בתחילה בשרידים שנוצרו מהגרעין הסומטי הישן ובשברי הגרעין המופרדים במהלך השלבים המוקדמים של האוטוגמיה. עם הופעת האנלאגן הגרעיני, חלבון ההיתוך עבר לעבר הגרעינים המתפתחים החדשים הללו (איור 4). כדי לטפח את הביוטינילציה של הפרוטאום הפרוקסימלי בשלבים השונים, השלמנו את התרבית עם 500 מיקרומטר ביוטין למשך שעתיים לפני קצירת התאים ל-IF. דמיינו את החלבונים המסומנים בביוטין באמצעות צביעת IF באמצעות סטרפטווידין מתויג פלואורסצנטי. האות שנצפה תאם את הלוקליזציה של חלבון ההיתוך המתויג HA. חשוב לציין, ניתן היה להשיג לוקליזציה של ביוטינילציה ספציפית לשלבי ההתפתחות הגרעיניים השונים, שכן אפילו דגירה קצרה עם ביוטין מספיקה להשגת ביוטינילציה משמעותית (איור 4). בנוסף, ללא תוספת של ביוטין משלים, ניתן היה לזהות רק ביוטינילציה זניחה בתאים שהוזרקו. בתאים מסוג בר, תוספת של ביוטין משלים לא גרמה לביוטינילציה ניתנת לזיהוי (איור 5א). יש לציין כי הביוטין לא רק הצטבר בגרעין המתפתח, שכן גם בתנאי דנטורציה, הוא נשאר מחובר לחלבונים. (איור 5ב). באמצעות חרוזים מגנטיים מצופים סטרפטווידין, ניתן היה להעשיר באופן סלקטיבי את החלבונים הביוטיניים (איור 6). ניתן לזהות את החלבונים המועשרים באמצעות ספקטרומטריית מסה. בניסויי זיהוי החלבונים הבאים הללו, התרבית ללא תוספת, כמו גם תאים המבטאים חלבון טורבו-ID שאינו מאוחד, יכולים לשמש כקבוצות ביקורת רקע.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig1.jpg"> 
איור 1: סקירה כללית של ההליך לביוטינילציה של קרבה ב-P. tetraurelia. (א) מתווה כללי של הפרוטוקול. (B) עקרון השיבוט עבור וקטור מקבל ה-turboID plug-and-play והמבנה המתקבל עבור חלבון ההיתוך Nowa1. אזור 3'UTR המשמש בפלסמיד זה נגזר מ-CenH3a. (C) טיפות מפוזרות גלויות שכלולות באזור הכהה יותר שמתאים לגרעין הסומטי (MAC) לאחר הזרקה מוצלחת של דנ"א. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig2.jpg"> 
איור 2: בדיקת PCR להזרקה מוצלחת. ניתוח ג'ל אגרוז של תגובת PCR למוצר עם פריימר קדמי ספציפי לאזור במעלה הזרם המקודד לעמידות לאמפיצילין (התחלת אמפר) ופריימר הפוך משלים ל-Nowa1. ראש החץ מציג את גודל המוצר הצפוי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig3.jpg"> 
איור 3: צביעה אימונופלואורסצנטית כדי לאמת את הלוקליזציה הנכונה של חלבון ההיתוך turboID. צביעה אימונופלואורסצנטית באמצעות נוגדן ראשוני ארנב-אנטי-HA (1:100) ונוגדנים משניים מצומדים נגד ארנב Alexa Fluor 568 (1:1000) של קווי Paramecium חד-שבטיים עם אות PCR חיובי ל-DNA המקודד חלבון היתוך Nowa1-HA-turboID. קנה מידה 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig4.jpg"> 
איור 4: ביוטינילציה ספציפית ל-Nowa1 בשלבי התפתחות שונים. צביעה אימונופלואורסצנטית של הקו החד-שבטי 2 בשלבים מתקדמים במהלך היווצרות הגרעין הסומטי החדש. מדיום התרבית הוסיף 500 מיקרומטר ביוטין לפעילות טורבו-ID אופטימלית. תג HA זוהה כמו באיור 3, וביוטין זוהה באמצעות Streptavidin-FITC (1:200). קנה מידה 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig5.jpg"> 
איור 5: תיוג קרבה יעיל על ידי turboID דורש ביוטין משלים בתרבית. (A) צביעה אימונופלואורסצנטית של wt ותאים מוזרקים בשלב ההתפתחותי המאוחר המראה את הביטוי של Nowa1-HA-turboID ואת הביוטינילציה הנצפית עם ביוטין משלים של 500 מיקרומטר. HA-tag וביוטין זוהו כמו באיור 4. קנה מידה 20 מיקרומטר. (B) ניתוח כתמים מערביים לביוטין באמצעות HRP-סטרפטווידין של תאי wt שגודלו עם 500 מיקרומטר ביוטין ותאים שהוזרקו עם ובלי ביוטין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig6.jpg"> 
איור 6: העשרה של חלבונים ביוטיניליים עם חרוזים מגנטיים של סטרפטווידין. ניתוח כתמים מערביים לביוטין של דגימות מניסוי משיכה באמצעות חרוזים מגנטיים מצופים סטרפטווידין. הדגימות הן: ליזאט תא Nowa1-HA-turboID (קלט), השבר הלא קשור (זרימה), שלבי הכביסה (שטיפה 1-6) והחלבונים הקשורים לחרוזים (פלט). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

ב Vivo ביוטינילציה של קרבה למחקרי אינטראקציה בין חלבונים ב-Paramecium tetraurelia

Paramecium is a major model organism for the study of molecular mechanisms involved in programmed genomic rearrangements and transposon elimination during ...

in-vivo-proximity-biotinylation-for-protein-interaction-studies

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

וידאו זה מראה ניסויים עם ניתוח בדיעבד של חלבונים אינטראקציות על ידי שימוש במיקרו בדוגמת משטחים. הגישה מציעה את האפשרות לזהות אינטראקציות חלבון בתאים חיים, והוא משלב יכולות התפוקה גבוהה עם אפשרות לחלץ מידע כמותי.

In-vivo גילוי של חלבונים אינטראקציות על מיקרו-בדוגמת משטחים

פרוטוקול זה מתאר כיצד חלבונים תמונה אינטראקציות באמצעות assay סריג מבוססי הקרבה.

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo</em

סרטון זה מתאר את בדיקת קשירת הקרבה כדי לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון באתרן בתאי נמטודה. הקרבה של החלבונים המעניינים יוצרת את תבנית הדנ"א המעגלית בעזרת גשושית PLA המחוברת לנוגדן משני. הגשושית מוגברת עוד יותר באמצעות תמיסת ההגברה, המייצרת DNA חד גדילי ארוך ואחריו הכלאה של הגשושית הגלאי, המאפשרת לוקליזציה של אינטראקציות חלבון-חלבון בתאים.

בדיקת קשירת קרבה ללימוד אינטראקציות חלבון-חלבון באתרו

כאן, אנו מתארים הליך לחזות ולכמת עם רגישות גבוהה האינטראקציות אנדוגני בין הרטיקולום ואת המיטוכונדריה endoplasmic בתאים קבוע. הפרוטוקול כולל אופטימיזציה assay קשירת הקרבה באתרו מיקוד אינוסיטול 1,4,5-אדנוזין קולטן / גלוקוז מוסדר חלבון 75 / ערוץ אניון תלוי מתח / cyclophilin D מורכבים על ממשק הקרום קשור המיטוכונדריה.

לחקר endoplasmic reticulum ואת המיטוכונדריה אינטראקציות על ידי<em&gt; באתרו</em&gt; Assay קשירת הסמיכות בתאים קבועים

כתב יד זה מתאר את הפרוטוקול לטיהור ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה זיקה (BiCAP). שיטה חדשנית זו מקלה על ספציפיות בידוד ואפיון פרוטיאומיה מבנית במורד הזרם של כל שני חלבונים אינטראקציה, בעוד למעט האו ם-ומורכבת חלבונים בודדים, כמו גם מתחמי הקים עם שותפים איגוד מתחרות.

ויבתר חלבון רב מתחמי איתות על ידי טיהור זיקה קומפלמנטציה ריאקציה דו-מולקולרית (BiCAP)

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לנטר את הרכבה ופירוק של הרעלן גחלת באמצעות biolayer אינטרפרומטריה (בלי). בעקבות הרכבה/פירוק על פני ביוסנסור, משתחררים את מתחמי חלבון גדולה מפני השטח עבור פריט חזותי וזיהוי של רכיבי מתחמי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני ו ספקטרומטר מסה, בהתאמה.

ניתוח דינאמי חלבון מתחמי נאסף בנושא ושוחרר מן Biolayer אינטרפרומטריה ביוסנסור באמצעות ספקטרומטר מסה ואלקטרון

הציגו כאן הם פרוטוקולים עבור ביוכימית מחוץ למבחנה המשתמשת בתוויות ביוטין שעשוי להיות מתאים באופן נרחב עבור לימוד אינטראקציות חלבון-גרעין של חומצה.

בתוך מבחנה ביוכימית באמצעות תוויות Biotin ללמוד חלבון-גרעין חומצה אינטראקציות

פרוטוקול זה מדגים את השימוש בסדר הקירבה הצמוד כדי לבדוק את האינטראקציות של חלבון חלבון באתרו בתוך C. אלגיה germline.

באיתור באתרו של האסיפה המורכבת של ריבונאופאנפרוטאין ב -C. אלגיה germline באמצעות שיטת הסמיכות

פרוטוקול להדמיית המיקרוטובולות הדינמיות ב-vivo באמצעות חלבון מחייב קצה עם תווית פלואורסצנטית הוצג. תיארנו את השיטות לתיוג, תמונה וניתוח המיקרוטובולות הדינמיות בתאי העצב של מיקרוטובול לרוחב אחורי (PLM) של C. elegans.

In vivo הערכה של מיקרוטובולה דינמיקה והתמצאות ב Caenorhabditis elegans נוירונים

העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET) היא טכניקת הדמיה לאיתור אינטראקציות של חלבונים בתאים חיים. כאן מוצג פרוטוקול FRET כדי לחקור את הקשר של אנזימים משני היסטון עם גורמי שעתוק המגייסים אותם למקדמי היעד לוויסות אפיגנטי של ביטוי גנים ברקמות צמחים.

חקירת אינטראקציות בין אנזימים המשנים היסטון לבין גורמי שעתוק in vivo על ידי העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית

במחקר זה, אנו קובעים פרוטוקול מפורט לתיוג קרבה מבוסס TurboID (PL) בשחלות D. melanogaster , המכסה שלבים מתוספת ביוטין ודיסקציה של שחלות ועד לאימות ביטוי טרנסגנים והעשרה של פפטידים ביוטיניליים לספקטרומטריית מסה.

ב Vivo יישום של תיוג קירבה מבוסס TurboID ב-Drosophila melanogaster

למד שיטת ביוטינילציה חיה ב-Paramecium tetraurelia באמצעות ליגאזת turboID לחקר אינטראקציות חלבוניות. השיטה מאפשרת עשרת חלבונים מסומנים וניתנת להתאמה לגנים שונים.

ב Vivo ביוטינילציה של קרבה למחקרי אינטראקציה בין חלבונים ב-Paramecium tetraurelia

גלה סרטונים נוספים