יצירת גנום חיידקי שלם מדגימות קליניות באמצעות זרימת עבודה של העשרת מטרה

גנומים יכולים לספק מידע על המוצא, ההעברה והיכולות של פתוגן. עבור חיידקים שאינם ניתנים לתרבית, ניתן להשיג מידע זה רק באמצעות העשרת מטרה. ריצוף פתוגנים חיידקיים ישירות מדגימות קליניות הוא מאתגר בגלל הדנ"א האנושי העצום, המיקרוביוטה המגוונת ועומסי החיידקים הנמוכים במיוחד.

במקרים רבים, תרבות אינה אופציה, בשל שיטת הדגימה והחיידקים הקפדניים. תוך כדי יישום טכנולוגיה זו על חיידקים המועברים במגע מיני, גילינו שושלת חדשה של Chlamydia trachomatis LGV הנקראת ompA-genotype L4, ואישרנו התרחבות גלובלית של שושלת LGV הדומיננטית, וסיפקנו תובנות מפתח לאבחון מולקולרי ומעקב אפידמיולוגי. פרוטוקול העשרה זה מאפשר התאוששות מלאה של הגנום מדגימות קליניות חיוביות של מחלות מין.

מצאנו שטכניקה זו עולה על ריצוף עמוק מטגנומי, דלדול DNA מארח וריצוף אדפטיבי של ננו-נקבוביות. אנו חוקרים את הזנים המסתובבים של פתוגנים אלה ברחבי אירופה ובארגנטינה. יש לכך פוטנציאל ליידע לגבי העברה וניהול אנטי-מיקרוביאלי.

כדי להתחיל, מדוד את ריכוז ה-DNA של תמציות ה-DNA מדגימות קליניות בשיטה רגישה ומדויקת מבוססת פלואורסצנטיות. לדלל כל דגימת DNA באמצעות מים נטולי נוקלאז ל-10 עד 200 ננוגרם בנפח סופי של 17 מיקרוליטר בכל רצועת צינור PCR. הוסף 3 מיקרוליטר של תערובת מאסטר פיצול לכל באר המכילה את 17 המיקרוליטרים של DNA מדולל.

פיפטה למעלה ולמטה 20 פעמים כדי לערבב היטב. לאחר מכן, אטום את רצועת צינור ה-PCR. מערבל את הרצועה במהירות גבוהה למשך 10 שניות וסובב קצרות כדי לאסוף את התוכן.

לאחר מכן, הנח את רצועת צינור ה-PCR במחזור התרמי והתחל את הפרוטוקול המתוכנת מראש לפיצול ודגירה. לאחר מכן, הכינו את התיקון הסופי ואת תערובת המאסטר של זנב ה-dA כפי שמוצג בטבלה. מערבולת וסובב את הצינור כפי שהוצג קודם לכן ושמור אותו על קרח.

לאחר מכן, פיפטה 20 מיקרוליטר של תיקון הקצה ותערובת מאסטר זנב dA לכל באר המכילה 50 מיקרוליטר של שברי DNA. אטום את הרצועה והמערבולת במהירות גבוהה למשך שמונה שניות. לאחר סיבוב קצר של הרצועה, הכנס אותה בחזרה למחזור התרמי.

לאחר סיום תוכנית המחזור התרמי, הנח את רצועת צינור ה-PCR על קרח. לאחר מכן, הוסיפו 25 מיקרוליטר של תערובת מאסטר קשירה בטמפרטורת החדר, שהוכנה 30 עד 45 דקות מראש לכל באר המכילה את שברי ה-DNA. הוסף 5 מיקרוליטר של תערובת אוליגו מתאם לספריות מתויגות NBC לכל באר.

הכנס מיד את רצועת צינור ה-PCR בחזרה לתוך המחזורי התרמי והמשך בתוכנית. כדי להתחיל בטיהור DNA, אחזר את החרוזים המגנטיים מ-4 מעלות צלזיוס ואפשר להם להגיע לטמפרטורת החדר לפני השימוש. לאחר מכן, הוסף 80 מיקרוליטר לכל דגימה היטב.

הנח את רצועת צינור ה-PCR על המעמד המגנטי ושטוף כל באר פעמיים עם 200 מיקרוליטר של 70% אתנול. המתן דקה אחת במהלך כל שטיפה והסר בזהירות את האתנול מבלי להפריע לחרוזים המגנטיים. לאחר ערבוב ודגירה של החרוזים עם 35 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז למשך חמש דקות, שאפו בזהירות את הסופרנטנט המנוקה מכל באר והעבירו אותו לבאר מתאימה ברצועת צינור PCR חדשה.

הנח את רצועת צינור ה-PCR החדשה על קרח והשליך את החרוזים המגנטיים. קח את תערובת תגובת ה-PCR המוכנה לפני הלכידה מחדש והוסף 11 מיקרוליטר ממנה לכל דגימה המכילה את ספריית ה-DNA המטוהר. הוסף 5 מיקרוליטר של תיקון האינדקס הראשוני שנבחר לכל תגובה ואטום את רצועת צינור ה-PCR.

התחל את תוכנית המחזור התרמי להגברת PCR כמפורט בטבלה כדי לבצע את ה-PCR לפני הלכידה. הוסף את רצועת צינור ה-PCR רק לאחר שהמחזור התרמי הגיע ל-98 מעלות צלזיוס. לאחר השלמת ה-PCR לפני הלכידה, בצע ניקוי נוסף מבוסס חרוזים כדי לטהר את הספרייה.

דגרו את מוצר ה-PCR בעזרת חרוזים מגנטיים. לאחר מכן, הנח את צינור רצועת ה-PCR על מכשיר הפרדה מגנטי והמתן 5 עד 10 דקות עד שהתמיסה תתבהר. בזמן שהרצועה נשארת על המעמד המגנטי, הסר בזהירות והשליך את הסופרנטנט השקוף מכל באר.

לאחר מכן, הוציא את ה-DNA ב-15 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז ומדוד את ריכוז ה-DNA של ספריית ה-DNA המטוהר. עבור הכלאה לדוגמה, תכנת את המחזור התרמי על פי הפרוטוקול המצוין כאן. הפעל את התוכנית והשהה מיד את הריצה.

מדללים 500 עד 1,000 ננוגרם מספריות ה-DNA המוכנות לנפח סופי של 12 מיקרוליטר באמצעות מים נטולי נוקלאז. לאחר מערבולת וסיבוב תערובת חוסם האוליגונוקלאוטיד, הוסף 5 מיקרוליטר לכל צינור דגימה. אטום את רצועת צינור ה-PCR והנח אותה במחזור התרמי.

השהה את המחזור התרמי כאשר הוא מגיע לשלב השלישי של הפרוטוקול. הוסף 13 מיקרוליטר מתערובת הכלאת הבדיקה המוכנה בטמפרטורת החדר לכל דגימה תוך שמירה על הרצועה בתוך המחזור התרמי. פיפטה לאט למעלה ולמטה 8 עד 10 פעמים לערבוב.

ודא שאין בועות אוויר, והנח את הרצועה בחזרה לתוך המחזור התרמי. לאחר מכן, ודא שכל הצינורות אטומים היטב. כדי ללכוד את הספרייה ההיברידית, העבירו את כל הנפח מכל צינור לצינורות המתאימים המכילים 200 מיקרוליטר של חרוזי סטרפטווידין שטופים מראש.

אוספים את חרוזי הסטרפטווידין לפני שטיפתם עם מאגר כביסה בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת רצועת צינור ה-PCR מהמפריד המגנטי, הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר כביסה בטמפרטורה גבוהה שחומם מראש ל-70 מעלות צלזיוס והשעיה מחדש של החרוזים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. אטום את רצועת הצינור, מערבולת במהירות גבוהה וסובב במהירות כפי שהודגם קודם לכן.

הנח את רצועת הצינור האטום בבלוק המחזור התרמי בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס ודגר למשך 5 דקות. העבר את רצועת צינור ה-PCR מהמחזור התרמי בחזרה למפריד המגנטי בטמפרטורת החדר. המתן דקה אחת עד שהפתרון יתבהר.

לאחר מכן, הסר בזהירות והשליך את הסופרנטנט. לאחר מכן, הוסיפו 25 מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז לכל צינור שמכיל את החרוזים. תכנת את המחזור התרמי כמפורט בטבלה המוצגת כאן.

הוסף 25 מיקרוליטר מתערובת תגובת ה-PCR המוכנה לאחר הלכידה לכל צינור דגימה. מערבבים את התגובה עד שהמתלה אחיד, ואטומים היטב את רצועת צינור ה-PCR מבלי לסובב אותה כלפי מטה. הנח את רצועת צינור ה-PCR האטומה במחזור התרמי.

לאחר העברת מוצר ה-PCR לצינור טרי, הוסף 50 מיקרוליטר של תרחיף חרוזים לכל צינור דגימה ובצע את ניקוי ה-DNA כפי שהוצג קודם לכן. למדוד את ריכוז ה-DNA של ה-DNA המטוהר הסופי באמצעות שיטת כימות מבוססת פלואורסצנטיות. העשרת המטרה הביאה לאחוזים גבוהים משמעותית של קריאות על המטרה, ולכן גנומים שלמים בהשוואה לריצוף ישיר על פני כל הפתוגנים שנבדקו, כולל Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum ו-Mycoplasma Genitalium.

הצלחת ריצוף הגנום נצפתה בעיקר בדגימות עם ערכי סף מחזור qPCR מתחת ל-30 עבור כל ארבעת הפתוגנים. עם מתאם הפוך ברור בין ערכי CT לאחוז הקריאות על המטרה עבור כלמידיה טרכומטיס. באמצעות טמפרטורת הכלאה של 62.5 מעלות צלזיוס בהשוואה ל-65 מעלות צלזיוס הקודמות, שיפר את כיסוי הגנום של מיקופלזמה גניטליום מבלי להפחית את הביצועים עבור פתוגנים המטרה האחרים.

ניתוח פילוגנטי של גנומים של כלמידיה טרכומטיס מארגנטינה הראה דגימות רבות שהתקבצו בתוך קבוצת L2b וחשף שושלת חדשה שהוצעה כגנוטיפ L4 של ompA המופרד מכל הגנומים הקודמים של LGV על ידי כ-600 פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים.