Name: יצירת גנום חיידקי שלם מדגימות קליניות באמצעות זרימת עבודה של העשרת מטרה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-15T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: למד שיטת ריצוף גנום שלם לחיידקים מדגימות קליניות באמצעות העשרת מטרה. הפרוטוקול מאפשר שחזור גנומי מלא של Chlamydia trachomatis ופתוגנים נוספים לצורך מעקב אפידמיולוגי ואבחון מולקולרי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Lefterova, M. I., Suarez, C. J., Banaei, N., Pinsky, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+for+infectious+disease+diagnosis+and+management%3A+a+report+of+the+Association+for+Molecular+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing for infectious disease diagnosis and management: a report of the Association for Molecular Pathology.</a> J Mol Diagn. 17 (6), 623-634 (2015).</li>
<li>Gwinn, M., Maccannell, D., Armstrong, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+sequencing+of+infectious+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Next generation sequencing of infectious pathogens.</a> JAMA. 321 (9), 893-894 (2019).</li>
<li>Hasman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+whole-genome+sequencing+for+detection+and+characterization+of+microorganisms+directly+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid whole-genome sequencing for detection and characterization of microorganisms directly from clinical samples.</a> J Clin Microbiol. 52 (1), 139-146 (2014).</li>
<li>Gautam, S., KC, R., Leong, K. W. C., Mac Aogáin, M., O'Toole, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+step-by-step+beginner%27s+protocol+for+whole+genome+sequencing+of+human+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Methods%22%5BJournal%5D)">A step-by-step beginner's protocol for whole genome sequencing of human bacterial pathogens.</a> J Biol Methods. 6 (1), e110(2019).</li>
<li>Baert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance+document+on+the+use+of+whole+genome+sequencing+%28WGS%29+for+source+tracking+from+a+food+industry+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Control%22%5BJournal%5D)">Guidance document on the use of whole genome sequencing (WGS) for source tracking from a food industry perspective.</a> Food Control. 130, 108148(2021).</li>
<li>Didelot, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+clinical+microbiology+with+bacterial+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing.</a> Nat Rev Genet. 13 (9), 601-612 (2012).</li>
<li>Scidmore, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+and+laboratory+maintenance+of+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cultivation and laboratory maintenance of Chlamydia trachomatis.</a> Curr Protoc Microbiol. 11, (2006).</li>
<li>Edmondson, D. G., Norris, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cultivation+of+the+syphilis+spirochete+Treponema+pallidum%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro cultivation of the syphilis spirochete Treponema pallidum.</a> Curr Protoc. 1 (2), e44(2021).</li>
<li>Pitt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+in+vitro+propagation+and+antimicrobial+susceptibility+testing+of+Mycoplasma+genitalium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Challenges of in vitro propagation and antimicrobial susceptibility testing of Mycoplasma genitalium.</a> J Antimicrob Chemother. 77 (11), 2901-2907 (2022).</li>
<li>Büttner, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+methods+for+genome+sequencing+of+Chlamydia+trachomatis+and+other+sexually+transmitted+bacteria+directly+from+clinical+swabs%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Genom%22%5BJournal%5D)">Evaluating methods for genome sequencing of Chlamydia trachomatis and other sexually transmitted bacteria directly from clinical swabs.</a> Microb Genom. 11 (2), 001353(2025).</li>
<li>Seth-Smith, H. M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+sequences+of+Chlamydia+trachomatis+directly+from+clinical+samples+without+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture.</a> Genome Res. 23 (5), 855-866 (2013).</li>
<li>SureSelect XT HS2 DNA kits: library preparation (+/-MBC) / fast-Hyb target enrichment / post-capture pooling workflow for Illumina platform NGS. , Agilent Technologies. 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G9983-90000.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G9983-90000.pdf</a> (2023).</li>
<li>Büttner, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+genomes+from+rectal+samples%3A+description+of+a+new+clade+comprising+ompA-genotype+L4+from+Argentina%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Genom%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis genomes from rectal samples: description of a new clade comprising ompA-genotype L4 from Argentina.</a> Microb Genom. 11 (2), 001350(2025).</li>
<li>Brown, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+whole-genome+sequencing+by+SureSelect+target+enrichment%3A+a+robust+and+sensitive+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Norovirus whole-genome sequencing by SureSelect target enrichment: a robust and sensitive method.</a> J Clin Microbiol. 54 (10), 2530-2537 (2016).</li>
<li>Dao, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+SureSelect+target+enrichment+system+for+next-generation+sequencing+to+obtain+the+complete+genome+sequence+of+bovine+leukemia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Application of the SureSelect target enrichment system for next-generation sequencing to obtain the complete genome sequence of bovine leukemia virus.</a> Arch Virol. 163 (11), 3155-3159 (2018).</li>
<li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SureSelect+targeted+enrichment%2C+a+new+cost+effective+method+for+the+whole+genome+sequencing+of+Candidatus+Liberibacterasiaticus%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">SureSelect targeted enrichment, a new cost effective method for the whole genome sequencing of Candidatus Liberibacterasiaticus.</a> Sci Rep. 9 (1), 1-8 (2019).</li>
<li>Büttner, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ompA+sequencing+and+multilocus+sequence+typing+of+lymphogranuloma+venereum+cases+in+Buenos+Aires+reveal+new+Chlamydia+trachomatis+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">ompA sequencing and multilocus sequence typing of lymphogranuloma venereum cases in Buenos Aires reveal new Chlamydia trachomatis genotypes.</a> Microorganisms. 12 (3), 587(2024).</li>
<li>La Rosa, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+anorectal+infections+by+LGV+%28L1%2C+L2+and+L2b%29+and+non-LGV+serotypes+in+symptomatic+patients+in+Buenos+Aires+Argentina%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+STD+AIDS%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis anorectal infections by LGV (L1, L2 and L2b) and non-LGV serotypes in symptomatic patients in Buenos Aires Argentina.</a> Int J STD AIDS. 32 (14), 1270-1278 (2021).</li>
<li>Rodríguez Fermepin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+L2b+in+rectal+lymphogranuloma+venereum%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Microbe%22%5BJournal%5D)">More than L2b in rectal lymphogranuloma venereum.</a> Lancet Microbe. 2 (2), e55(2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>פיפטה 8 ערוצים 0.5-10 ומיקרו; L</td><td>אפנדורף</td><td>3125000010</td><td>מחקר אפנדורף&nbsp; פלוס, 8 ערוצים, 0.5-10 ומיקרו; L, אפור בינוני, נפח משתנה.</td></tr><tr><td>פיפטה 8 ערוצים 10-100 ומיקרו; L</td><td>אפנדורף</td><td>3125000036</td><td>מחקר אפנדורף&nbsp; בנוסף, 8 ערוצים, 10-100 ומיקרו; L, צהוב, נפח משתנה.</td></tr><tr><td>מתאם Oligo Mix עבור ספריות עם תיוג MBC</td><td>אג'ילנט טכנולוגיות</td><td>5500-0147</td><td>חלק מערכת ההכנה לספריית SureSelect XT HS2 עבור ILM (Pre PCR).</td></tr><tr><td>מערכת מיצוי חומצות גרעין אוטומטית באמצעות ערכת מיצוי DNA ויראלי/פתוגן</td><td>קיגן</td><td>937036 (ערכה) / 9001297 (כלי נגינה)</td><td>מכשיר QIAsymphony SP/AS המשמש עם ערכת וירוסים/פתוגנים QIAamp DSP לחילוץ DNA אוטומטי.</td></tr><tr><td>מאגר מחייב</td><td>אג'ילנט טכנולוגיות</td><td>5190-9687</td><td>חלק מערכת העשרת היעד של SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (לאחר PCR).</td></tr><tr><td>ערכת מיצוי DNA ומכשיר אוטומטי</td><td>תאגיד המחקר זימו</td><td>D3024/D3025</td><td>ערכת Quick-DNA Miniprep המשמשת למיצוי DNA כולל מדגימות קליניות. תהליכי עבודה ידניים או אוטומטיים.</td></tr><tr><td>End Repair- תערובת אנזימי זנב</td><td>אג'ילנט טכנולוגיות</td><td>5500-0147</td><td>חלק מערכת ההכנה לספריית SureSelect XT HS2 עבור ILM (Pre PCR).</td></tr><tr><td>מאגר זנב לתיקון סוף</td><td>אג'ילנט טכנולוגיות</td><td>5500-0147</td><td>חלק מערכת ההכנה לספריית SureSelect XT HS2 עבור ILM (Pre PCR).</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>VWR כימיקלים BDH</td><td>20816.298</td><td>אתנול מוחלט &ge; 99.5% Ph. Eur., USP</td></tr><tr><td>פלואורומטר עם בדיקת dsDNA ברגישות גבוהה / שיטה מבוססת פלואורסצנטי לכימות DNA</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק (Invitrogen)</td><td>Q33238, Q33231</td><td>פלואורומטר קיוביט 4 עם ערכת בדיקה 1X dsDNA רגישות גבוהה (HS).</td></tr><tr><td>מאגר פיצול</td><td>אג'ילנט טכנולוגיות</td><td>5191-4080</td><td>חלק מערכת הפיצול האנזימי של SureSelect עם השם ''5X Fragmentation Buffer''.</td></tr><tr><td>אנזים פיצול</td><td>אג'ילנט טכנולוגיות</td><td>5191-4080</td><td>חלק מערכת הפיצול האנזימי של SureSelect.</td></tr><tr><td>מאגר DNA פולימראז בנאמנות גבוהה</td><td>אג'ילנט טכנולוגיות</td><td>5500-0147</td><td>חלק מערכת ההכנה לספריית SureSelect XT HS2 עבור ILM (Pre PCR) עם השם ''Herculase II Buffer''.</td></tr><tr><td>מאגר DNA פולימראז בנאמנות גבוהה עם dNTPs (5X)</td><td>אג'ילנט טכנולוגיות</td><td>5190-9687</td><td>חלק מערכת העשרת היעד של SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) עם השם ''Herculase II Buffer''.</td></tr><tr><td>אנזים היתוך בנאמנות גבוהה להגברת PCR</td><td>אג'ילנט טכנולוגיות</td><td>5191-5688</td><td>חלק מערכת העשרת היעד של SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) עם השם ''Herculase II''.</td></tr><tr><td>מאגר כביסה בטמפרטורה גבוהה</td><td>אג'ילנט טכנולוגיות</td><td>5190-9687</td><td>חלק מ-SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) עם השם ''Wash buffer 2''.</td></tr><tr><td>מאגר הכלאה&nbsp;</td><td>אג'ילנט טכנולוגיות</td><td>5500-0147</td><td>חלק מערכת ההכנה לספריית SureSelect XT HS2 עבור ILM (Pre PCR).</td></tr><tr><td>פריימרים לרצף סדורים באינדקס</td><td>אג'ילנט טכנולוגיות</td><td>5500-0147</td><td>חלק מזוגות פריימר אינדקס SureSelect XT HS2 1-96 עבור ILM (Pre PCR).</td></tr><tr><td>בדיקת PCR בזמן אמת מולטיפלקס פנימי</td><td>טיב מולביול</td><td>לא ישים</td><td>בדיקה שפותחה ומוסמכת על ידי החברה המבוססת על ערכות Lightmix לגילוי STI</td></tr><tr><td>מאגר קשירה</td><td>אג'ילנט טכנולוגיות</td><td>5500-0147</td><td>חלק מערכת ההכנה לספריית SureSelect XT HS2 עבור ILM (Pre PCR).</td></tr><tr><td>חרוזים מגנטיים לניקוי</td><td>אג'ילנט טכנולוגיות</td><td>5191-5740</td><td>חרוזי SureSelect DNA AMPure XP.</td></tr><tr><td>מעמד מגנטי</td><td>תוכנת מעבדה של פרמגן</td><td>MSRLV08</td><td>0.2 מ"ל PCR 8 רצועות מפריד מגנטי 5 ומיקרו; L ~ 0.2 מ"ל נפח.</td></tr><tr><td>ריצוף מהדור הבא (NGS): מערכת ריצוף לקריאה קצרה בתפוקה גבוהה&nbsp;</td><td>אילומינה בע"מ</td><td>לא ישים</td><td>ריצוף מזווג של 150 bp (PE150) מבוצע על פלטפורמות Illumina NextSeq1000 ו-MiSeq.</td></tr><tr><td>מים ללא נוקלאז</td><td>ביוקונספט</td><td>3-07F04-H</td><td>מים לביולוגיה מולקולרית, ללא DNA/DNAse/RNase, סטריליים, ללא מעכבי PCR.</td></tr><tr><td>תערובת חוסמי אוליגונוקלאוטיד&nbsp;</td><td>אג'ילנט טכנולוגיות</td><td>5500-0147</td><td>חלק מערכת ההכנה לספריית SureSelect XT HS2 עבור ILM (Pre PCR).</td></tr><tr><td>רצועת צינור PCR</td><td>avantor, נמסר על ידי VWR&nbsp; &nbsp;</td><td>732-3608</td><td>רצועות צינור PCR עם מכסים שטוחים מחוברים.</td></tr><tr><td>תערובת פריימר לאחר הצילום</td><td>אג'ילנט טכנולוגיות</td><td>5190-9687</td><td>חלק מערכת העשרת היעד של SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (לאחר PCR).</td></tr><tr><td>בדיקת RNA</td><td>אג'ילנט טכנולוגיות</td><td>5191-6916&nbsp;</td><td>בדיקה SureSelect Custom Tier4 6Mb-11.9Mb, למשל מזהה עיצוב S3465164).</td></tr><tr><td>חוסם RNase</td><td>אג'ילנט טכנולוגיות</td><td>5500-0147</td><td>חלק מערכת ההכנה לספריית SureSelect XT HS2 עבור ILM (Pre PCR).</td></tr><tr><td>מאגר כביסה בטמפרטורת החדר</td><td>אג'ילנט טכנולוגיות</td><td>5190-9687</td><td>ערכת העשרת יעד SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) עם השם ''מאגר כביסה 1''.</td></tr><tr><td>חרוזי סטרפטווידין</td><td>אג'ילנט טכנולוגיות</td><td>5191-5742</td><td>SureSelect חרוזי סטרפטווידין.</td></tr><tr><td>T4 DNA ליגאז</td><td>אג'ילנט טכנולוגיות</td><td>5500-0147</td><td>חלק מערכת ההכנה לספריית SureSelect XT HS2 עבור ILM (Pre PCR).</td></tr><tr><td>שיטת העשרת מטרה / שיטת לכידת DNA</td><td>אג'ילנט טכנולוגיות</td><td>G9983-90000</td><td>ערכת DNA SureSelect XT HS2 עם הכנת ספרייה, העשרת יעדים מהירה-Hyb וזרימת עבודה של איגום לאחר לכידה. גרסת פרוטוקול F0, מאי 2023. עבור פלטפורמת Illumina NGS</td></tr><tr><td>ערכת בדיקת העשרת מטרה עבור C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum, ו-M. genitalium</td><td>טכנולוגיות אג'ילנט / המעבדה למיקרוביולוגיה מעשירה (IMM, UZH)</td><td>מזהה עיצוב S3465164</td><td>סט בדיקה מעוצב בהתאמה אישית (~242,000 בדיקות) ללכידת מולטיפלקס של ארבעה פתוגנים של STI. תכנון המבוסס על גנום ייחוס מרובה.</td></tr><tr><td>מחזור תרמי</td><td>תרמופישר.</td><td>4375305</td><td>Veriti 96-Well Thermal Cycler.</td></tr></tbody></table>

יצירת גנום חיידקי שלם מדגימות קליניות באמצעות זרימת עבודה של העשרת מטרה

Generating Whole Bacterial Genomes from Clinical Samples using a Target Enrichment Workflow

מחקר על התפרצות C. trachomatis LGV בבואנוס איירס, ארגנטינה, הראה כמה מאפיינים חדשים בדגימות, כלומר, 10 החלפות נוקלאוטידים בגן ompA בהשוואה ל-ompA-genotype L1, ורצף Multi-Locus Sequence Typing (MLST) יוצא דופן מסוג 2 17,18,19. מטרתנו הייתה לחקור את הגנומים מהדגימות הקליניות הללו, ולמקם אותם בהקשר של נתונים גלובליים. כדי להשיג זאת, השווינו את הביצועים של גישת העשרת מטרה עם ריצוף מטאגנומי ישיר עבור WGS של מחלות מין חיידקיות מדגימות קליניות, בניסיון להתגבר על האתגרים שמציבים עומסי חיידקים נמוכים ושפע של DNA אנושי ומיקרוביאלי.
ה-DNA ששימש היה מדגימות ספוגית פי הטבעת שנאספו בין השנים 2017 ל-2023 בבואנוס איירס, ארגנטינה, הונחו במדיום 2-SP (מדיום סוכרוז-פוספט) בתוספת 2% סרום עגל עוברי (FCS) ואנטיביוטיקה (גנטמיצין 25 מיקרוגרם/מ"ל, ונקומיצין 0.5 מ"ג/מ"ל ואמפוטריצין B 2.5 מיקרוגרם/מ"ל) ואוחסנו ב-80 מעלות צלזיוס, או שופכה, אנורקטלית, וספוגיות לוע שנאספו בבית החולים האוניברסיטאי בציריך (USZ) במאגר NAATs (בדיקות הגברה של חומצות גרעין). DNA מדגימות בואנוס איירס חולץ באמצעות ערכת מיצוי ידנית מבוססת סיליקה, בעוד DNA מדגימות USZ חולץ באמצעות מערכת אוטומטית מבוססת חרוזים מגנטיים.
כל הדגימות הקליניות שנכללו במחקר זה אושרו כחיוביות על ידי בדיקת PCR בזמן אמת שפותחה על ידי החברה (ראה טבלת חומרים) עם ערכי סף מחזור qPCR (Ct) הנעים כדלקמן: C. trachomatis: 17-34, N. gonorrhoeae:  24-31, T. pallidum: 27-36, ו-M. genitalium:  30-37. ריכוז ה-DNA כומת באמצעות בדיקה פלואורומטרית ברגישות גבוהה לפני הריצוף כדי לאפיין את חומר הקלט של הדגימות הקליניות (ראה טבלת חומרים).
כדי להשוות ריצוף מטאגנומי ישיר להעשרת מטרה, השתמשנו ב-32 דגימות, מתוכן 29 היו חיוביות ל-C. trachomatis, תשע ל-N. gonorrhoeae, חמש ל-T. pallidum ושלוש ל-M. genitalium. ריצוף מטגנומי ישיר לא הביא לגנום שלם ואכן בקושי השיג נתוני מטרה מעל קו הבסיס שנצפה בדגימות שליליות. העשרת מטרה עם הכלאה ב-65 מעלות צלזיוס הביאה לתוצאות טובות בהרבה עבור כל פתוגן, וגנומים מוצלחים הושגו במקרים רבים משיטה זו (איור 1). 
כדי להעריך את בחירת הדגימה האופטימלית להעשרת מטרה, הערכנו את הקשר בין ערכי qPCR Ct אבחנתיים לבין יעילות התאוששות הגנום, כפי שנמדד על ידי אחוז הקריאות על המטרה (%OTR). מדד זה משקף את שיעור קריאות הריצוף הממופות לגנום של אורגניזם המטרה ומשמש בדרך כלל להערכת ביצועי העשרה. נמצא מתאם מובהק בין עומס פתוגן להצלחת ריצוף עבור C. trachomatis, עם חתך Ct להצלחה סביב Ct30. למרות שהנתונים עבור פתוגנים המטרה האחרים היו מוגבלים, נצפתה מגמה דומה, שבה הצלחת ריצוף הגנום התרחשה בעיקר בדגימות עם עומס פתוגן מתחת ל-Ct30 (איור 2).
ניסוי זה עם טמפרטורת הכלאה של 65 מעלות צלזיוס העניק שיעורי הצלחה בריצוף הגנום עם העשרת מטרה של 75%-80% עבור C. trachomatis, N. gonorrhoaee ו-T. pallidum, בהתבסס על דגימות עם ערכי Ct מתחת ל-30. לשלוש הדגימות החיוביות של M. genitalium היו ערכי Ct של 30-37 והשיגו כיסוי גנומי נמוך יותר ועומק קריאה ממוצע. על מנת לשפר את התוצאות הללו, התנסינו בהפחתת טמפרטורת ההכלאה, המשפרת את ההכלאה בשל תכולת ה-%G+C הנמוכה בגנום של M. genitalium . באמצעות טמפרטורות הכלאה נמוכות יותר, כמו למשל הטמפרטורה המומלצת כיום של 62.5 מעלות צלזיוס, אנו יכולים לשפר את ההתאוששות של גנומים של M. genitalium מבלי לפגוע בהתאוששות של גנומים אחרים (איור 3). תוצאות אלו מוכיחות כי העשרת מטרה היא גישה יעילה להשגת מידע גנומי בעל ערך מדגימות קליניות וניתן להתאים אותה למגוון רחב של גנומים, גם על פני עיצוב מבוסס פאנל.
ניתוח פילוגנטי של הגנום המועשר בהצלחה של C. trachomatis הראה שרוב הדגימות מבואנוס איירס מתקבצות בתוך קבוצת הגנוטיפ OmpA-L2b, מה שמרמז על שושלת מוצלחת עם מחזור עולמי. הניתוח חשף גם נוכחות של שושלת חדשה ומובחנת בארגנטינה, הגורמת ל-LGV. הדגימות מקבוצה זו שונות בכ-600 SNPs משושלות LGV האחרות, ושושלת זו מוצעת כ-ompA-genotype L4 (איור 4). תיאור מפורט של הדגימות המשמשות באיור 1, איור 2 ואיור 4 מסופק בטבלה משלימה 1.
ממצאים אלה מדגישים את הערך של העשרת מטרה בחקר מגוון פתוגנים ומדגימים רמה גבוהה של הצלחה בריצוף גנום מדגימות קליניות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig1.jpg"> 
איור 1: העשרת גנומים באמצעות העשרת מטרה בהשוואה לריצוף מטגנומי ישיר. אחוז הקריאות על המטרה (%OTR), המוגדר כאחוז קריאות הרצף הממופות לגנום של אורגניזם המטרה, מראה את מידת ההעשרה שהושגה עם העשרת מטרה. הקו מייצג את החציון של כל נקודות הנתונים, והתיבה מציינת את הטווח הבין-רבעוני (IQR) של 50%. צבעי נקודות הנתונים תואמים למקור המדגם: כחול חיוור עבור ארגנטינה ואדום עבור שוויץ. הצלחה בריצוף הגנום, המוגדרת ככיסוי &gt;95% ועומק קריאה ממוצע &gt;10, מיוצגת על ידי נקודות גדולות, בעוד שכשל מסומן על ידי נקודות קטנות. שימו לב לסולמות השונים על ציר ה-y. קיצורים: CT = C. trachomatis, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. נתון זה שונהמ-10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig2.jpg"> 
איור 2: מתאם של %OTR מהעשרת יעד עם ערכי qPCR Ct אבחנתיים. צבעי נקודת הנתונים מייצגים את מקור המדגם: כחול חיוור עבור ארגנטינה ואדום עבור שווייץ. הצלחת ריצוף הגנום, המוגדרת ככיסוי &gt;95% ועומק קריאה ממוצע &gt;10, מסומנת על ידי נקודות גדולות, בעוד שהכישלון מיוצג על ידי נקודות קטנות. שימו לב לסולמות השונים על ציר ה-y. קיצורים: CT = C. trachomatis, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. נתון זה שונהמ-10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig3.jpg"> 
איור 3: השפעת טמפרטורת ההכלאה על התאוששות גנומים שלמים על פני כל הפתוגנים החיידקיים של STI בעשר דגימות. ה-DNA האנושי בטווח של זה בדגימות קליניות הועלה עם ריכוזים ידועים של DNA חיידקי מטרה בנפרד (יחיד) וגם לגמרי כדי לייצג דגימה עם זיהומים מרובים (מאוגד). בוצעו שני ניסויים, כל אחד עם חמשת הפתוגנים/שילובים: 0.01% ו-0.03% כדי לייצג את האחוז המשוער של DNA מכל מיקרואורגניזם ביחס ל-DNA הכולל בדגימה (ה-DNA הנותר תואם ל-DNA האנושי). ההתאוששות של M. genitalium משתפרת בטמפרטורות נמוכות יותר. C. trachomatis הדנ"א נבדק בריכוז נמוך; ניסויים נוספים מראים שהטמפרטורות לא השפיעו על התאוששות הגנום של C. trachomatis (נתונים לא מוצגים). קיצורים: CT = C. trachomatis, MG = M. genitalium, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig4.jpg"> 
איור 4: פילוגנזה מותאמת רקומבינציה של זני LGV מארגנטינה. הניתוח כולל את כל הגנומים הזמינים של LGV עם נתונים שפורסמו. מטא-נתונים המוצגים מימין לפילוגנזה כוללים דגימות מטופלים כפולות, ניתוח בייסיאני של מבנה האוכלוסייה (BAPS; אשכול = קלייד, כאשר אשכול BAPS הפוליפילטי 6 מייצג את המגוון הגנטי של האוכלוסייה), שיטת ריצוף גנום (נתונים ממחקר זה), גנוטיפ ompA , מדינה ושנה, כפי שמצוין במפתח בפינה השמאלית העליונה. נתונים חסרים מוצגים בלבן. שמות הגנום ממחקר זה מודגשים בכחול בהיר עבור ארגנטינה וכחול כהה עבור פינלנד (לא מתקבלים על ידי העשרת מטרה). צבעים אלה משמשים אך ורק כדי להבחין בין הגנומים שנוצרו במחקר זה. ערכי Bootstrap מ-1000 אתחולים מהירים במיוחד מוצגים כאחוזים בענפים העיקריים. נתון זה שונהמ-13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה משלימה 1: תיאור החומרים, הריאגנטים, המכשירים והציוד ששימשו במחקר. הטבלה כוללת מידע מפורט על השם המסחרי, היצרן והמספר הקטלוגי של הרכיבים המשמשים למיצוי DNA, הכנת ספרייה, העשרת יעד וריצוף. הוא כולל גם פריטים המשמשים לבדיקות qPCR פנימיות והליכים כלליים של ביולוגיה מולקולרית. ניתן להשתמש בחלופות שוות ערך עבור פריטים המסומנים בכוכבית (*). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/Supplementary_Table_1_RE.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.</a>

Obtaining complete genomes of bacterial sexually transmitted infections (STIs) directly from clinical samples is challenging due to the presence of human ...

generating-whole-bacterial-genomes-from-clinical-samples-using-target

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מתארים שיטה לביצוע ניתוח גנטי בכלמידיה מבוסס על mutagenesis הכימי וכל רצף הגנום. בנוסף, מערכת להמרת ה-DNA בתאים נגועים מתוארת שיכול לשמש למיפוי גנטי. שיטה זו יכולה להיות ישימה באופן נרחב למערכות חיידקים חסרות מערכות טרנספורמציה וכלים גנטיים מולקולריים.

גישות גנטיות בקדימה<em&gt; כלמידיה trachomatis</em

העשרת gDNA לריצוף NGS היא כלי קל ורב עוצמה לחקר מוטציות חוקתיות. במאמר זה, אנו מציגים את ההליך לניתוח פשוט של הרצף המלא של 11 גנים המעורבים בתיקון נזק ל-DNA.

gDNA העשרה על ידי טכנולוגיה מבוססת Transposase לניתוח NGS של הרצף השלם של BRCA1, BRCA2, ו -9 גנים המעורבים בתיקון נזק לדנ"א

מתוארת מערכת משולבת לריצוף ממוקד של הדור הבא של דגימות אונקולוגיות. מערכת חוצת פלטפורמות זו מותאמת לביופסיות גידול באיכות נמוכה ובכמות נמוכה, מתאימה לתשומות DNA נמוכות, כוללת בקרות מרובות וריאנטים מאופיינות היטב, וכוללת מתקשר וריאנט חדש המבוסס על אמצעי בקרת איכות כמותיים טרום-אנליטיים.

אינטגרציה של Wet ותהליכי ספסל יבשים מבצעת אופטימיזציה ממוקד רצף הדור הבא של איכות נמוכה וביופסיות גידול נמוכה כמות

אנחנו מתארים שיטה יעילה, איתנה, וחסכונית לחילוץ חומצות גרעין מן מטליות לאפיון של קהילות חיידקי באמצעות רצף amplicon הגן 16S rRNA. השיטה מאפשרת גישה עיבוד משותף סוגי מדגם מרובים ויכול להכיל מספר תהליכים טיפוליים במורד הזרם.

הפקת חומצות גרעין יעיל 16S rRNA ג&#39;ין רצף עבור בקטריאלי קהילת אפיון

כאן אנו מציגים פרוטוקול לחקור מתילציה DNA בגנום רחב במחקרים לסקירת חולים קליניים בקנה מידה גדול באמצעות רצף לכידת DNA מתיל-Binding (MBDCap-seq או MBD-seq) טכנולוגיה בצנרת ניתוח ביואינפורמטיקה שלאחר מכן.

רצף ללכוד מתיל-DNA מחייב עבור רקמות חולות

פרוטוקול זה נועד לשחזר ולהתכונן התאים היעד נדיר מתערובת עם תאי המטרה ללא רקע אפיון גנטי מולקולרי ברמת תא בודד. איכות ה-DNA שווה לתאים בודדים שאינם מטופלים ומאפשר יישום תא בודד (הקרנת שני מבוסס, ממוקד ניתוח).

הגברה עושר מראש ולא כל הגנום תא היעד עבור אפיון במורד הזרם תא בודד

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מתוקננת מפורט של תפוקה גבוהה מטוסי אף-16 rRNA-אמפליקון רצף. הפרוטוקול מציג פרוטוקול משולב, לובשי מדים, ריאלי וזולה החל באיסוף הנתונים ניתוחים דגימת צואה. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח של מספר רב של דוגמאות עם סטנדרטים קפדניים מספר פקדים.

פרוטוקול מודרך לקבלת צואה אפיון חיידקים על ידי מטוסי אף-16 rRNA-אמפליקון רצף

פרוטוקול זה מפרט גישה מקיפה עבור כתות, רצף, ואת הרכב הגנום ההיברידי דה נובו של חיידקי השתן. הוא מספק הליך לשחזור ליצירת רצפי גנום מעגליים שלמים שימושיים בחקר יסודות גנטיים כרומוזומליים ואקסטרכרומוזומליים התורמים לקולוניזציה של שתן, פתוגנזה והפצת התנגדות מיקרוביאלית.

הרכבה הגנום ההיברידית דה נובו לייצור גנומים שלמים של חיידקי השתן באמצעות טכנולוגיות רצף קצרות וארוכות

ההיתכנות של אסטרטגיות ריצוף גנום שלם (WGS) באמצעות מכשירי benchtop פישטה את חקירת הגנום של כל מיקרוב בעל רלוונטיות לבריאות הציבור בסביבה מעבדתית. מתוארת התאמה מתודולוגית של זרימת העבודה עבור WGS חיידקי ומוצג גם צינור ביואינפורמטיקה לניתוח.

אפיון זן Escherichia coli פתוגני שמקורו באוראוכרומיס spp. חוות המשתמשות בריצוף גנום שלם

מטה-פרוטאומיקה קלינית מציעה תובנות לגבי המיקרוביום האנושי ותרומתו למחלות. רתמנו את הכוח החישובי של פלטפורמת גלקסי כדי לפתח זרימת עבודה ביואינפורמטית מודולרית המאפשרת ניתוח מטא-פרוטאומי מבוסס ספקטרומטריית מסה מורכבת ואפיון של סוגי דגימות קליניות מגוונות הרלוונטיים למחקרי מחלות.

זרימת עבודה של מטה-פרוטאומיקה קלינית המיושמת בפלטפורמת הביואינפורמטיקה של גלקסי לניתוח אינטראקציות מארח-מיקרוביום העומדות בבסיס מחלות אנושיות

המחקר הנוכחי מתאר תהליך ריצוף ננו-נקבוביות של פלסמידים כאשר רצף הכרומוזומים כבר ידוע או אינו מעניין. שלב העשרת DNA בפלסמיד מבטיח עומק אופטימלי של רצף הפלסמידים וממקסם את מספר הדגימות שניתן לרצף בכל תא זרימה.

ריצוף והרכבה של פלסמידים לקריאה ארוכה באמצעות זרימות עבודה מבוססות ריצוף ננופורי

למד שיטת ריצוף גנום שלם לחיידקים מדגימות קליניות באמצעות העשרת מטרה. הפרוטוקול מאפשר שחזור גנומי מלא של Chlamydia trachomatis ופתוגנים נוספים לצורך מעקב אפידמיולוגי ואבחון מולקולרי.

יצירת גנום חיידקי שלם מדגימות קליניות באמצעות זרימת עבודה של העשרת מטרה

גלה סרטונים נוספים