כימות ויולאצין ב - Chromobacterium violaceum ועיכובו על ידי תרכובות ביו-אקטיביות

מטרת המחקר שלנו היא לזהות תרכובות המעכבות חישת מניין, המווסתת פנוטיפים מרכזיים. פרוטוקול זה מסנן מולקולות המפחיתות את ייצור הסגול מבלי להשפיע על צמיחת החיידקים, מה שמרמז על הפרעה בחישת מניין. מחקרים אחרונים זיהו תרכובות ביו-אקטיביות חדשות המעכבות חישת מניין מבלי להשפיע על צמיחת חיידקים, ומחזקות את הפוטנציאל שלהן כסוכנים אנטי-אלימים נגד חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה.

האתגרים העיקריים כוללים את הספציפיות של עיכוב חישת מניין, מכיוון שתרכובות עשויות להשפיע על הצמיחה או על התכונות. בפרוטוקול זה הנקרא כימות איזון השפעה של כבוד ומסיסות דורש טיפול זהיר. הקמנו פרוטוקול המשמש בתרכובות ביו-אקטיביות בריכוזים תת-מעכבים שאינם משפיעים על גדילת החיידקים.

זוהי הנחת מפתח להתחלת איתות חישת מניין שונה ממחקר אנטי-מיקרוביאלי. נתמקד בזיהוי מעכבי מצב מניין חדשים ומנגנוני עיכוב תקשורת, במיוחד בחיידקים הרלוונטיים למזון ולבריאות. כדי להתחיל, גדל תרבית של חמישה מיליליטר של כרומובקטריום ויולאסום ATCC 12472 במרק לוריא ברטאני או LB.

דגרו את התרבית בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד המוגדר על 220 סיבובים לדקה למשך 24 שעות. מדוד את הצפיפות האופטית של תרבית הלילה והתאם אותה בערך פי 10 בחזקת שמונה יחידות יוצרות מושבה למיליליטר. שימוש במרק LB.

להכנת תרכובת, שקלו את התרכובת הביו-אקטיבית ודללו אותה ב-DMSO טהור או בתערובת אחד לאחד של DMSO ומים, בהתאם למסיסות. קח צלחת תחתונה שטוחה של 96 באר והוסף מרק LB יחד עם התרכובת הביו-אקטיבית על פי תוכנית דילול סדרתית. כדי לחשב את הנפח הנדרש של תמיסת המלאי לריכוז הרצוי בכל באר, יש למרוח את הנוסחה.

בעמודה הראשונה של כל סט דילול דגנים. הוסף 196 מיקרוליטר מרק לוריא ברטאני לעמודות שלוש, חמש ושבע. לאחר מכן, בעמודות הבאות המשמשות לדילול, הוסף 100 מיקרוליטר של מרק לוריא ברטאני לעמודות ארבע, שש ושמונה.

כדי להתחיל את הדילול הסדרתי, הוסף ארבעה מיקרוליטרים של התרכובת הביו-אקטיבית לבאר הראשונה של כל סט, המתאימה לעמודות שלוש, חמש ושבע. לאחר הערבוב מעבירים 100 מיקרוליטר מכל באר לעמוד הסמוך. כדי להמשיך את הדילול הסדרתי עד לעמודות 4, 6 ו-8.

חזור על כל ההליך בשלוש עותקים עבור כל ריכוז של כל תרכובת באמצעות טיפים טריים כדי למנוע זיהום צולב. מוסיפים 80 מיקרוליטר מרק לוריא ברטאני לשורות B עד D בכל הבארות. מה שמביא את הסך הכולל ל-180 מיקרוליטר לבאר.

לאחר מכן הוסיפו 20 מיקרוליטר של תרבית הכרומובקטריום הסגול הסטנדרטית מהתכשיר הקודם לכל אחת מאותן בארות, והגיעו לנפח סופי של 200 מיקרוליטר. מבוסס על תאימות הספקטרופוטומטר. מכסים את המיקרופלייט במכסה או בסרט איטום כדי למנוע אידוי.

דגרו את הצלחת האטומה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם תסיסה ב -130 סיבובים לדקה למשך 24 שעות. לאחר הדגירה מעבירים את הצלחת לחממת ייבוש המוגדרת על 60 מעלות צלזיוס. הסירו את המכסה והניחו לו להתייבש לחלוטין במשך כשמונה שעות.

לאחר הייבוש, הוציאו את הצלחת מהחממה והוסיפו 200 מיקרוליטר DMSO טהור לכל באר. מכסים את הצלחת ומדגרים אותה בחום של 25 מעלות צלזיוס בניעור במהירות של 130 סיבובים לדקה למשך 30 דקות כדי להמיס את פיגמנט הסגול. לאחר הדגירה, העבירו בזהירות 100 מיקרוליטר מתמיסת הסגול המומסת למיקרופלטה חדשה.

הימנעות ממגע בין קצה הפיפטה לדפנות הבאר. מדוד את הספיגה של ויולצאין ב-595 ננומטר בספקטרופוטומטר מיקרו-פלייט עם מכסה כדי למנוע זיהום. יש לנער במשך חמש שניות לפני כל קריאה ולבצע את הקריאה עם מכסה כדי למנוע זיהום.

כדי לחשב את ייצור הוויולצאין, הפחיתו תחילה את ספיגת הריק מכל דגימה כדי לא לכלול הפרעות רקע, ולאחר מכן חישבו את אחוז הסגול באמצעות הבקרה הלא מטופלת כהתייחסות למשוואה. שלוש תרכובות ביו-אקטיביות, רסברטרול, פרנזול ולינאלול נבדקו ליכולתן לעכב ייצור ויולצאין בכרומובקטריום ויולאסיום ATCC 12472. פרנזול הפחית משמעותית את ייצור הסגול ל-9% ב-200 מיקרוגרם למיליליטר ול-19% ב-100 מיקרוגרם למיליליטר, בהשוואה ל-100% בביקורת הלא מטופלת.

טיפול בלינאלול ב-200 ו-100 מיקרוגרם למיליליטר הביא לייצור ויולצאין של 32%, והראה עיכוב של 68% ביחס לביקורת. רזברטרול במינון של 25 מיקרוגרם למיליליטר הפחית את ייצור הסגול ל-15%, ואילו ב-12 מיקרוגרם למיליליטר הוא הגיע ל-30% בהשוואה ל-100% בקבוצת הביקורת הלא מטופלת. תמונות מיקרופלייט אישרו חזותית פיגמנטציה מופחתת של ויולאצין עבור כל הטיפולים בהשוואה לביקורת הלא מטופלת.