נביטה אסימביוטית והתחדשות מבוססת עלים של סחלב המרפא בסכנת הכחדה Hemipilia cucullata מזרעים בוגרים

המחקר שלי מתמקד באופטימיזציה של פרוטוקולי תרבית רקמות עבור סחלבים בסכנת הכחדה כדי לשפר את השימור, ריבוי בקנה מידה גדול וניצול בר-קיימא של צמחי המרפא היקרים הללו. אתגר מרכזי הוא השגת שיעורי נביטה והתחדשות עקביים על פני מיני סחלבים, שכן כל אחד מהם דורש אופטימיזציה של מדיה ספציפית למין ובקרה מדויקת של תנאי הגידול. פיתחנו פרוטוקולים יעילים של תרביות רקמה עבור צמחים רבים בסכנת הכחדה, המאפשרים התאוששות מינים ותומכים בשיקום לבתי גידול טבעיים.

לא קיימת מערכת תרבית רקמה יעילה הניתנת לשחזור עבור Hemipilia cucullata המטפלת בריבוי, שיקום ושימור. סחלבים יבשתיים זקוקים לרוב לפטריות סימביוטיות ספציפיות שהבידוד והזיהוי שלהן מורכבים. שיטה סימביוטית מפשטת את ההתפשטות ועוקפת את השלבים הללו.

הפרקטיקה שלנו מאפשרת נביטה גבוהה והתחדשות מהירה של צמחים ממצבים בוגרים, מבטלת תלות פטרייתית ומציעה גישה מהירה ואמינה יותר להפצת Hemipilia cucullata. כדי להתחיל, הניחו את הקפסולה בכוס. הוסף טיפה אחת עד שתיים של חומר ניקוי לכוס לשטיפה.

שטפו את הקפסולה תחת מי ברז זורמים למשך חמש דקות. לאחר מכן, בעזרת נייר סופג סטרילי, הסר את שארית מי השטח מהקפסולה. כעת, טבלו את הקפסולה ב-75% אתנול למשך 30 שניות.

עקרו את הקפסולה על ידי טבילתה ב-50 מיליליטר של תמיסת נתרן היפוכלוריט 20% המכילה כ-5% כלור זמין. לאחר מכן הוסיפו לתמיסה שתי טיפות של חומר ניקוי לשטיפת כלים ביתית לא מדוללת ודגרו על הקפסולה למשך 10 עד 12 דקות. שטפו את הקפסולה חמש פעמים במים מזוקקים סטריליים כדי להסיר שאריות חומר חיטוי.

לאחר מכן בעזרת אזמל סטרילי, הסר כמילימטר אחד הן מהקודקוד והן מקצות הפדיקל של הקפסולה. בצע חתך קטן בקצה העליון של הקפסולה כדי לחשוף את הזרעים ולאסוף אותם בצלחת פטרי סטרילית. בעזרת מלקחיים סטריליים יש לפזר באופן שווה כ -500 עד 600 זרעים לכל בקבוק תרבית המכיל את המדיום המוכן.

הניחו לזרעים לספוג מים ולהתייצב בתחתית המדיום הנוזלי. שמרו על התרביות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עם מחזור אור וחושך של 12 שעות ועוצמת אור של 36 מיקרומול למ"ר לשנייה. התבונן בנביטת זרעים מדי שבוע.

תעד את כל השינויים המורפולוגיים הנראים לעין וצלם את התרבויות לתיעוד. בחר צמחים בריאים בגודל של סנטימטר עד שני סנטימטרים ללא השחרה גלויה או הצהבה מוחלטת להתארכות יורה. בעזרת מלקחיים מעוקרים ומקוררים, העבירו באופן אספטי 8-12 צמחים לכל בקבוק המכיל מדיום התארכות יורה טרי שהוכן מראש.

מחלקים באופן שווה את השתילים בתוך כל בקבוק. לאחר חמישה שבועות של התארכות יורה, בחר שתילים עם יורה מפותח לחלוטין ועלים בריאים לדגימת עלים. כרתו עלים סטריליים מורחבים לחלוטין מצמח בריא באמצעות אזמל סטרילי.

הסר את האזור האפיקלי ואת שולי העלה. לאחר מכן חותכים כל עלה למקטעים בגודל של כ- 0.5 על 0.5 סנטימטר בעזרת אזמל סטרילי בתנאים אספטיים. הנח 10 קטעי עלים על מדיום האינדוקציה PLB כשהמשטח האדקסיאלי פונה כלפי מעלה.

ודא שכל קטע נוגע במדיום בחוזקה. לאחר מכן תרבו אותם במשך חמישה שבועות. לבסוף, הערך את מספר ה- PLBs שהושרו בהצלחה וחשב את שיעור האינדוקציה באחוזים.

רשום את גובה הניצן הממוצע בסנטימטרים וספור את מספר הניצנים שנוצרו בכל הוצאה. נביטת זרעים במדיום נוזלי התאפיינה באופן ניכר בהופעת עוברים ירוקים ממעטפת הזרע בסביבות 60 יום, אשר לאחר מכן יצרו פרוטוקורים כדוריים ב-80 עד 85 יום. שיעור הנביטה הגבוה ביותר של 72% הושג במדיום נוזלי בתוספת 0.5 מיליגרם לליטר NAA.

מדיום B5 המכיל 0.5 מיליגרם לליטר בנזילאדנין ו-0.2 מיליגרם לליטר NAA הניב את קצב התפשטות הפרוטוקורים הגבוה ביותר בממוצע של 5.3 פרוטוקורים חדשים שנוצרו לכל צמח. פרוטוקורים שגודלו במדיום B5 עם שילוב מווסת גדילה אופטימלי הראו צמיחה נמרצת ופיגמנטציה ירוקה בריאה, וביצועיהם עלו על אלה שגודלו במדיום טרשת נפוצה באותם תנאים. המספר הגבוה ביותר של ענפים לשתול בממוצע ארבעה נצפה עם מיליגרם אחד לליטר של כל בנזילאדנין ו-NAA, ואחריו NAA לבדו עם 0.5 מיליגרם לליטר.

התארכות היורה השתפרה ביותר עם שילוב של 0.5 מיליגרם לליטר בנזילאדנין ומיליגרם אחד לליטר NAA, וכתוצאה מכך גובה הצמח הממוצע היה 4.8 סנטימטרים. שיעור האינדוקציה הגבוה ביותר של גופים דמויי פרוטוקור 44.3% הושג באמצעות שלושה מיליגרם לליטר בנזילדנין עם 0.2 מיליגרם לליטר NAA.