סריקת טומוגרפיה של מיקרוסקופ אלקטרונים שידור בווירולוגיה: הדמיה תלת מימדית של דגימות קפואות בלחץ גבוה, שהוחלפו בהקפאה

זיהום ויראלי עלול לגרום לשינויים משמעותיים בתשתיות התאים. כדי להמחיש את השינויים הללו בתלת-ממד, אנו משתמשים בטומוגרפיית STEM להדמיית תאים נגועים בוירוס. טומוגרפיית STEM גוזלת זמן ודורשת עבודה אינטנסיבית.

דבר זה הופך את הכנת הדגימה המיטבית לחיונית לדגימות ביולוגיות, כגון קבוצות נגועות וירוס. טומוגרפיית STEM קונבנציונלית מוגבלת למחלות דגימות בגודל של כ-200 ננומטר. הפרוטוקול שלנו מאפשר הדמיה תלת-ממדית של חתכים עבים יותר.

דבר זה מאפשר הדמיה מקיפה יותר של תאים נגועים בוירוס והשינויים המבניים האולטרה. רבים מהווירוסים האונקוליטיים הם במקור ניסויים קליניים, ולכן חוקרים ומפתחים ברחבי העולם עובדים יחד, והמדע דוחף את גבולות הטיפול בסרטן, ושיטות מתקדמות כמו מיקרוסקופיה אלקטרונית וטומוגרפיית STEM תורמות לתובנות חדשות. נמשיך לענות על שאלות וירולוגיות באמצעות טומוגרפיה STEM ומשלבים אותה עם פרוטוקולי הכנה חדשים וטכניקות מיקרוסקופיה נוספות.

כדי להתחיל, מלא את תיבת ה-LN בחנקן נוזלי כהכנה לטיפול והעברת דיסקי הספיר הקפואים ממחזיק הקפאה בלחץ גבוה או HPF אל קפסולות האחסון. שמור דוואר מלא בחנקן נוזלי בקרבת מקום כדי למלא את קופסת ה-LN לפי הצורך במהלך תהליך ההקפאה. תשמור על פינצטה מבודדת מוכנה.

הכן את מיכלי הדגימה שיחזיקו את דיסקי הספיר אחרי ה-HPF. ודאו שיש להם מכסה ומספר חורים לזרימת חנקן נוזלי, ומשקולות קטנות כדי לוודא שהם לא צפים. שים את מיכל התווית בקופסת ה-LN לקירור מוקדם לפני השימוש.

לאחר מכן, שים את הדגימות באינקובטור. בדקו את דיסקי הספיר תחת מיקרוסקופ אור הפוך כדי לוודא מספיק תאים ואיכות תאים טובה לפני תחילת הקפאה בלחץ גבוה. כדי לבצע HPF, קחו דיסק ספיר אחד מהצלחת ומרחו במהירות על נייר סינון כדי להסיר עודפי מדיום.

הניחו את הדיסק במחזיק ה-HPF כאשר הצד המצופה בקרבון פונה כלפי מעלה, כדי להבטיח שהמספר שתיים יהיה קריא. טבל מרווח זהב בהקסדקן והנח אותו בעדינות על דיסק הספיר. מקם דיסק ספיר שני מעל המרווח כאשר הצד המצופה פחמן פונה כלפי מטה כדי ליצור תצורת סנדוויץ' כאשר התאים פונים זה אל זה, וודא שאין אוויר כלוא.

סגור את מחזיק ה-HPF בזהירות ובמהירות כדי להפחית את העומס על הדגימה. הכנס את מחזיק ה-HPF למקפיא בלחץ גבוה. נעל אותו לפי הוראות היצרן והתחל את תהליך ההקפאה.

לאחר מכן, העבר את מחזיק ה-HPF לקופסת ה-LN. ואז להעביר את הקצה שנושא את דיסקי הספיר לקופסת ה-LN שהתקררה לפני הקירור. הוצא בזהירות את הדיסקים מהמחזיק.

הניחו את מבחנות הקריו הסגורות המלאות בתמיסת החלפה חופשית בתוך מכשיר החלפה חופשית מקורר מראש למינוס 90 מעלות צלזיוס. חכה עד שהתמיסה תגיע לאותה טמפרטורה. פינצטה לפני קירור, סכין ומלקחיים גדולים על ידי טבילה בחנקן נוזלי לשימוש בהעברת דיסקי הספיר.

העבר את הדגימות המוקפאות בלחץ גבוה למכשיר ההחלפה החופשית. הפרדו את דיסקי הספיר אחד אחד, תוך שמירה על חנקן נוזלי. ולהעביר במהירות כל דיסק בנפרד לבקבוקון קריו עם תמיסת החלפה חופשית, כדי להבטיח שהדיסק יהיה שקוע לחלוטין.

לאחר סגירת בקבוקון הקריו, החזר מיד אותו למכשיר ההחלפה החופשי. לאחר שכל הדגימות הונחו, התחילו בתהליך ההחלפה. ברגע שהדגימות יגיעו ל-20 מעלות צלזיוס.

המשך לשטוף את הדגימות שלוש פעמים במשך 30 דקות כל אחת עם 100% אצטון. כדי להטמיע מראש את הדגימות, דגרו אותן בשליש שרף אפוקסי ושני שלישים באצטון למשך שעה. לאחר דגירה של הדגימות עם שני שלישים שרף אפוקסי ושליש אצטון למשך שעה, החלפת התמיסה עם שרף אפוקסי 100% ודגירה למשך הלילה עם מכסה הבקבוקון פתוח כדי לאפשר לאצטון שנותר להתאדות ביום הבא, העבר את דיסקי הספיר לצינורות תגובה חדשים עם תווית מלאה בשרף אפוקסי טרי.

מקם את הדיסקים כשהם נתמכים אופקית על ידי דופן הצינור, כדי לוודא שהצד עם התאים פונה כלפי מעלה. לאחר מכן מניחים את צינורות התגובה עם המכסים פתוחים בתנור מכוון ל-60 מעלות צלזיוס ותנו לשרף להתפשט לפחות 48 שעות. לאחר ששרף האפוקסי פולימר, טבלו את קצה צינור התגובה הסגור בחנקן נוזלי למשך כ-10 שניות.

לחץ על צינור התגובה על שולחן כדי לשחרר את בלוק השרף. דיסק הספיר ייפרד בקלות משכבת הפחמן, שנשארת מחוברת לתאים המוטמעים. בחר את אזור העניין במדגם המוטמע וצמצם את גודל המדגם לאזור העניין.

באמצעות מיקרוטון אולטרה עם סכין יהלום, אספו קטעים בעובי של כ-1 מיקרומטר על רשת מוט מקביל טעונה בפולי-אל-ליזין עבור דימות STEM וטומוגרפיית STEM. טפלו בחלקים בזהב קולואידי כסמנים פידוציאליים ומרחו ציפוי פחמן. לאחר חיתוך ובדיקת חלקים דקים במיוחד, הדגימות מוכנות להדמיה.

בהתבסס על שאלת המחקר, הכניסו או את גלאי השדה הבהיר, את גלאי השדה האפל, או את שניהם. הפעל את מצב הסריקה וקבל תמונת בדיקה של הדגימה. בחר הגדלה גבוהה מ-800,000 פעמים, שהיא גדולה מההגדלה הסופית הרצויה.

ליד אזור העניין, כוונן את המיקוד ותקן אסטיגמציה תוך הימנעות מחשיפה ישירה לקרן באזורים הקריטיים של הדגימה. הגדר את הגובה האקסצנטרי כך שהאזור הרצוי, או התשואה (ROI) יישאר ממורכז לאורך טווח ההטיה. בחר תכונה ליד התשואה על ההשקעה, תביא אותו למרכז, תתמקד, תקן את האסטיגמטיזם, והטה את הבמה לצד צעד למינוס 72 מעלות.

כדי לבחור את שדה הראייה, חזרו ל-ROI, הביאו לפוקוס ולצלם תמונת סקירה. הגדר את ההגדלה הסופית הרצויה לרכישת סדרת טילט. הגדר רכישת תמונות אוטומטית בסדרת הטיה, הנעה ממינוס 72 מעלות ועד פלוס 72 מעלות, ותמונה כל 1.5 מעלות.

התחילו את רכישת סדרת הטלט האוטומטית. פרוסות וירטואליות מייצגות מהתרמוגרמה של STEM המחישו כיצד כיוון הוויריונים משפיע על נראות צורת הכדור האופיינית בתצוגות דו-ממדיות. רק ויריונים מיושרים במקביל למישור הצפייה הופיעו עם מורפולוגיית כדורים מוגדרת היטב, בעוד אחרים נראו עגולים או מוארכים, בהתאם לזווית ההטיה שלהם.

כדי להתגבר על מגבלות הכיוון של הדמיה דו-ממדית, נעשה שימוש בטומוגרפיית STEM ללכידת אשכולות גדולים של ויריון וירוס סטומטיטיס וזיקולרי רקומביננטי, מה שאפשר הערכה של צורת הוויריון בתלת-ממד ללא הטיית כיוון. תצוגת הצד של התרמוגרמה אישרה את היתרון הנפחי של טומוגרפיית STEM בלכידת ויריונים שלמים רבים בתוך חתך בעובי 600 ננומטר, בניגוד לדגימה המוגבלת האפשרית בחתך TEM של 200 ננומטר.