סריקת טומוגרפיה של מיקרוסקופ אלקטרונים שידור בווירולוגיה: הדמיה תלת מימדית של דגימות קפואות בלחץ גבוה, שהוחלפו בהקפאה
August 6th, 2025
פרוטוקול וידאו זה ממחיש כיצד לבצע טומוגרפיה של מיקרוסקופ אלקטרונים של שידור סריקה של דגימות וירולוגיה. לקבלת תוצאות מיטביות, הדגימות מוכנות על ידי הקפאה בלחץ גבוה והחלפת הקפאה לאחר מכן.
זיהום ויראלי עלול לגרום לשינויים משמעותיים בתשתיות התאים. כדי להמחיש את השינויים הללו בתלת-ממד, אנו משתמשים בטומוגרפיית STEM להדמיית תאים נגועים בוירוס. טומוגרפיית STEM גוזלת זמן ודורשת עבודה אינטנסיבית.
דבר זה הופך את הכנת הדגימה המיטבית לחיונית לדגימות ביולוגיות, כגון קבוצות נגועות וירוס. טומוגרפיית STEM קונבנציונלית מוגבלת למחלות דגימות בגודל של כ-200 ננומטר. הפרוטוקול שלנו מאפשר הדמיה תלת-ממדית של חתכים עבים יותר.
דבר זה מאפשר הדמיה מקיפה יותר של תאים נגועים בוירוס והשינויים המבניים האולטרה. רבים מהווירוסים האונקוליטיים הם במקור ניסויים קליניים, ולכן חוקרים ומפתחים ברחבי העולם עובדים יחד, והמדע דוחף את גבולות הטיפול בסרטן, ושיטות מתקדמות כמו מיקרוסקופיה אלקטרונית וטומוגרפיית STEM תורמות לתובנות חדשות. נמשיך לענות על שאלות וירולוגיות באמצעות טומוגרפיה STEM ומשלבים אותה עם פרוטוקולי הכנה חדשים וטכניקות מיקרוסקופיה נוספות.
כדי להתחיל, מלא את תיבת ה-LN בחנקן נוזלי כהכנה לטיפול והעברת דיסקי הספיר הקפואים ממחזיק הקפאה בלחץ גבוה או HPF אל קפסולות האחסון. שמור דוואר מלא בחנקן נוזלי בקרבת מקום כדי למלא את קופסת ה-LN לפי הצורך במהלך תהליך ההקפאה. תשמור על פינצטה מבודדת מוכנה.
הכן את מיכלי הדגימה שיחזיקו את דיסקי הספיר אחרי ה-HPF. ודאו שיש להם מכסה ומספר חורים לזרימת חנקן נוזלי, ומשקולות קטנות כדי לוודא שהם לא צפים. שים את מיכל התווית בקופסת ה-LN לקירור מוקדם לפני השימוש.
לאחר מכן, שים את הדגימות באינקובטור. בדקו את דיסקי הספיר תחת מיקרוסקופ אור הפוך כדי לוודא מספיק תאים ואיכות תאים טובה לפני תחילת הקפאה בלחץ גבוה. כדי לבצע HPF, קחו דיסק ספיר אחד מהצלחת ומרחו במהירות על נייר סינון כדי להסיר עודפי מדיום.
הניחו את הדיסק במחזיק ה-HPF כאשר הצד המצופה בקרבון פונה כלפי מעלה, כדי להבטיח שהמספר שתיים יהיה קריא. טבל מרווח זהב בהקסדקן והנח אותו בעדינות על דיסק הספיר. מקם דיסק ספיר שני מעל המרווח כאשר הצד המצופה פחמן פונה כלפי מטה כדי ליצור תצורת סנדוויץ' כאשר התאים פונים זה אל זה, וודא שאין אוויר כלוא.
סגור את מחזיק ה-HPF בזהירות ובמהירות כדי להפחית את העומס על הדגימה. הכנס את מחזיק ה-HPF למקפיא בלחץ גבוה. נעל אותו לפי הוראות היצרן והתחל את תהליך ההקפאה.
לאחר מכן, העבר את מחזיק ה-HPF לקופסת ה-LN. ואז להעביר את הקצה שנושא את דיסקי הספיר לקופסת ה-LN שהתקררה לפני הקירור. הוצא בזהירות את הדיסקים מהמחזיק.
הניחו את מבחנות הקריו הסגורות המלאות בתמיסת החלפה חופשית בתוך מכשיר החלפה חופשית מקורר מראש למינוס 90 מעלות צלזיוס. חכה עד שהתמיסה תגיע לאותה טמפרטורה. פינצטה לפני קירור, סכין ומלקחיים גדולים על ידי טבילה בחנקן נוזלי לשימוש בהעברת דיסקי הספיר.
העבר את הדגימות המוקפאות בלחץ גבוה למכשיר ההחלפה החופשית. הפרדו את דיסקי הספיר אחד אחד, תוך שמירה על חנקן נוזלי. ולהעביר במהירות כל דיסק בנפרד לבקבוקון קריו עם תמיסת החלפה חופשית, כדי להבטיח שהדיסק יהיה שקוע לחלוטין.
לאחר סגירת בקבוקון הקריו, החזר מיד אותו למכשיר ההחלפה החופשי. לאחר שכל הדגימות הונחו, התחילו בתהליך ההחלפה. ברגע שהדגימות יגיעו ל-20 מעלות צלזיוס.
המשך לשטוף את הדגימות שלוש פעמים במשך 30 דקות כל אחת עם 100% אצטון. כדי להטמיע מראש את הדגימות, דגרו אותן בשליש שרף אפוקסי ושני שלישים באצטון למשך שעה. לאחר דגירה של הדגימות עם שני שלישים שרף אפוקסי ושליש אצטון למשך שעה, החלפת התמיסה עם שרף אפוקסי 100% ודגירה למשך הלילה עם מכסה הבקבוקון פתוח כדי לאפשר לאצטון שנותר להתאדות ביום הבא, העבר את דיסקי הספיר לצינורות תגובה חדשים עם תווית מלאה בשרף אפוקסי טרי.
מקם את הדיסקים כשהם נתמכים אופקית על ידי דופן הצינור, כדי לוודא שהצד עם התאים פונה כלפי מעלה. לאחר מכן מניחים את צינורות התגובה עם המכסים פתוחים בתנור מכוון ל-60 מעלות צלזיוס ותנו לשרף להתפשט לפחות 48 שעות. לאחר ששרף האפוקסי פולימר, טבלו את קצה צינור התגובה הסגור בחנקן נוזלי למשך כ-10 שניות.
לחץ על צינור התגובה על שולחן כדי לשחרר את בלוק השרף. דיסק הספיר ייפרד בקלות משכבת הפחמן, שנשארת מחוברת לתאים המוטמעים. בחר את אזור העניין במדגם המוטמע וצמצם את גודל המדגם לאזור העניין.
באמצעות מיקרוטון אולטרה עם סכין יהלום, אספו קטעים בעובי של כ-1 מיקרומטר על רשת מוט מקביל טעונה בפולי-אל-ליזין עבור דימות STEM וטומוגרפיית STEM. טפלו בחלקים בזהב קולואידי כסמנים פידוציאליים ומרחו ציפוי פחמן. לאחר חיתוך ובדיקת חלקים דקים במיוחד, הדגימות מוכנות להדמיה.
בהתבסס על שאלת המחקר, הכניסו או את גלאי השדה הבהיר, את גלאי השדה האפל, או את שניהם. הפעל את מצב הסריקה וקבל תמונת בדיקה של הדגימה. בחר הגדלה גבוהה מ-800,000 פעמים, שהיא גדולה מההגדלה הסופית הרצויה.
ליד אזור העניין, כוונן את המיקוד ותקן אסטיגמציה תוך הימנעות מחשיפה ישירה לקרן באזורים הקריטיים של הדגימה. הגדר את הגובה האקסצנטרי כך שהאזור הרצוי, או התשואה (ROI) יישאר ממורכז לאורך טווח ההטיה. בחר תכונה ליד התשואה על ההשקעה, תביא אותו למרכז, תתמקד, תקן את האסטיגמטיזם, והטה את הבמה לצד צעד למינוס 72 מעלות.
כדי לבחור את שדה הראייה, חזרו ל-ROI, הביאו לפוקוס ולצלם תמונת סקירה. הגדר את ההגדלה הסופית הרצויה לרכישת סדרת טילט. הגדר רכישת תמונות אוטומטית בסדרת הטיה, הנעה ממינוס 72 מעלות ועד פלוס 72 מעלות, ותמונה כל 1.5 מעלות.
התחילו את רכישת סדרת הטלט האוטומטית. פרוסות וירטואליות מייצגות מהתרמוגרמה של STEM המחישו כיצד כיוון הוויריונים משפיע על נראות צורת הכדור האופיינית בתצוגות דו-ממדיות. רק ויריונים מיושרים במקביל למישור הצפייה הופיעו עם מורפולוגיית כדורים מוגדרת היטב, בעוד אחרים נראו עגולים או מוארכים, בהתאם לזווית ההטיה שלהם.
כדי להתגבר על מגבלות הכיוון של הדמיה דו-ממדית, נעשה שימוש בטומוגרפיית STEM ללכידת אשכולות גדולים של ויריון וירוס סטומטיטיס וזיקולרי רקומביננטי, מה שאפשר הערכה של צורת הוויריון בתלת-ממד ללא הטיית כיוון. תצוגת הצד של התרמוגרמה אישרה את היתרון הנפחי של טומוגרפיית STEM בלכידת ויריונים שלמים רבים בתוך חתך בעובי 600 ננומטר, בניגוד לדגימה המוגבלת האפשרית בחתך TEM של 200 ננומטר.
סקירה
פרוטוקול הוידאו הזה ממחיש כיצד לבצע טומוגרפיה של מיקרוסקופיית אלקטרונים בסריקה של דגימות וירולוגיות. הוא מדגיש את החשיבות של הכנת דגימות אופטימלית, כולל הקפאה בלחץ גבוה והחלפת הקפאה, כדי לדמיין שינויים תאיים בשלושה ממדים.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- וירולוגיה
- מיקרוסקופיית אלקטרונים
רקע
- זיהומים ויראליים יכולים לשנות משמעותית מבנים תאיים.
- טומוגרפיה STEM היא טכניקה בעלת ערך לדימות תאים נגועים בנגיף.
- שיטות קונבנציונליות מוגבלות לדגימות דקות, מה שמחייב פרוטוקולים משופרים.
- נגיפים אונקוליטיים נחקרים לטיפול בסרטן.
מטרת המחקר
- לספק פרוטוקול מפורט לדימות תלת-ממדי של חתכים עבים יותר של תאים נגועים בנגיף.
- לשפר את הדמיה של שינויים אולטרה-מבניים בתאים נגועים.
- לשלב טומוגרפיה STEM עם טכניקות הכנה חדשות לתובנות טובות יותר.
שיטות ששימשו
- הקפאה בלחץ גבוה (HPF) של דגימות.
- החלפת הקפאה לשימור דגימות.
- הטמעת דגימות בשרף אפוקסי לצורך חיתוך.
- שימוש במיקרוטום אולטרה לחיתוך חתכים דקים במיוחד לצורך הדמיה.
תוצאות עיקריות
- הכנה מוצלחת של דגימות לצורך הדמיה תלת-ממדית.
- דמיה משופרת של שינויים תאיים עקב זיהומים ויראליים.
- הוכחת האפקטיביות של הפרוטוקול החדש.
- תובנות לגבי השינויים המבניים שנגרמים על ידי נגיפים אונקוליטיים.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר הדמיה מקיפה של תאים נגועים בנגיף.
- שיטות הכנה חדשות משפרות את איכות תוצאות הטומוגרפיה STEM.
- גישה זו תורמת למחקר מתמשך בתחום הוירולוגיה וטיפול בסרטן.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Three-dimensional STEM tomography enables high-resolution visualization of virus-induced cellular ultrastructure changes, overcoming the limitations of conventional EM for thicker biological samples. This capability is critical for mechanistic de-risking and target validation in virology-driven therapeutic discovery, especially where viral morphogenesis or host-pathogen interactions inform portfolio decisions. Integrating advanced 3D imaging into early discovery workflows enhances predictive confidence and supports translational continuity for antiviral and oncolytic virus programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of virus-induced cellular remodeling at nanometer resolution.
- Supports functional target validation by visualizing replication organelles and virion morphogenesis in situ.
- Improves predictive confidence by revealing ultrastructural phenotypes inaccessible to 2D EM.
- Facilitates mechanistic de-risking for antiviral and oncolytic virus candidates.
Screening & Assay Development
- Provides validated 3D biological context for downstream phenotypic screening assays.
- Enables quantitative assessment of viral assembly and budding events in thick sections.
- Supports assay standardization by offering reproducible, high-content imaging outputs.
- Improves screening readiness for compounds targeting viral replication or host factors.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural virology insights with disease-relevant cellular models.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by correlating 3D ultrastructure with functional outcomes.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates by clarifying mechanism-of-action at the cellular level.
- Facilitates translational biomarker identification through correlative imaging approaches.
Pipeline & Workflow Integration
STEM tomography integrates into the discovery-to-preclinical continuum by bridging high-resolution structural analysis with functional virology and phenotypic screening.
- Discovery Biology: Provides robust hypothesis testing and pathway clarification for virus-host interactions.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible 3D imaging outputs for assay development.
- Analytics: Enables statistical comparison of virion morphology and replication organelle architecture across conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and mechanistic continuity from in vitro to in vivo models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for diverse virology and cell biology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in virology research.
- Operational Value: Standardizes 3D imaging workflows for reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by clarifying biological risk early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of antiviral and oncolytic virus assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in high-pressure freezing, freeze substitution, and advanced EM instrumentation.
- Demands access to STEM tomography platforms and robust analytical infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and imaging protocols.
- Adaptation may be needed for different virus types or cellular models.
- Time- and labor-intensive nature may limit throughput for large-scale screening.
