Name: שימוש בכלים אופטוגנטיים של LEXY ו-LINuS וניתוח תמונות אוטומטי כדי לכמת דינמיקת הובלה נוקלאוציטופלזמית בתאים חיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: למדו שימוש בכלים אופטוגנטיים לניתוח אוטומטי של הובלה נוקלאוציטופלזמית בתאים חיים. פרוטוקול זה מציג גישה חדשנית לחקר מנגנוני תחבורה תאוניים בביולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Wing, C. E., Fung, H. Y. J., Chook, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyopherin-mediated+nucleocytoplasmic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Karyopherin-mediated nucleocytoplasmic transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23, 307-328 (2022).</li>
<li>Kelley, J. B., Paschal, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+quantification+of+nucleocytoplasmic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based quantification of nucleocytoplasmic transport.</a> Methods. 157, 106-114 (2019).</li>
<li>Crefcoeur, R. P., Yin, R., Ulm, R., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet-B-mediated+induction+of+protein-protein+interactions+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet-B-mediated induction of protein-protein interactions in mammalian cells.</a> Nat Commun. 4 (2), 1779(2013).</li>
<li>Beyer, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+light-regulated+reversible+nuclear+localization+of+proteins+in+mammalian+cells+and+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Red light-regulated reversible nuclear localization of proteins in mammalian cells and zebrafish.</a> ACS Synth Biol. 4 (9), 951-958 (2015).</li>
<li>Niopek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+light-inducible+nuclear+localization+signals+for+precise+spatiotemporal+control+of+protein+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Engineering light-inducible nuclear localization signals for precise spatiotemporal control of protein dynamics in living cells.</a> Nat Commun. 5, 4404(2014).</li>
<li>Niopek, D., Wehler, P., Roensch, J., Eils, R., Di Ventura, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+nuclear+protein+export%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of nuclear protein export.</a> Nat Commun. 7, 10624(2016).</li>
<li>Zayner, J. P., Antoniou, C., Sosnick, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+terminal+helix+modulates+light+activated+conformational+changes+in+AsLOV2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The amino terminal helix modulates light activated conformational changes in AsLOV2.</a> J Mol Biol. 419 (1-2), 61-74 (2012).</li>
<li>Wehler, P., Niopek, D., Eils, R., Di Ventura, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+nuclear+protein+import+in+living+cells+using+light-inducible+nuclear+localization+signals+%28LINuS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of nuclear protein import in living cells using light-inducible nuclear localization signals (LINuS).</a> Curr Protoc Chem Biol. 8 (2), 131-145 (2016).</li>
<li>Lataster, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+by+optogenetically+regulated+cell+cycle+inhibitor+protein+p21%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control by optogenetically regulated cell cycle inhibitor protein p21.</a> Biology. 12 (9), 1194(2023).</li>
<li>Forlani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+slow-cycling+variants+of+the+light-inducible+nuclear+protein+export+system+LEXY+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of slow-cycling variants of the light-inducible nuclear protein export system LEXY in mammalian cells.</a> ACS Synth Biol. 11 (10), 3529-3533 (2022).</li>
<li>Inutsuka, A., Kimizuka, N., Takanohashi, N., Yakabu, H., Onaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+a+blue+light+transmission+area+in+living+animals+using+light-induced+nuclear+translocation+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Visualization of a blue light transmission area in living animals using light-induced nuclear translocation of fluorescent proteins.</a> Biochem Biophys Res Commun. 522 (1), 138-143 (2020).</li>
<li>Tinevez, J. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate%3A+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li>
<li>Schmidt, U., Weigert, M., Broaddus, C., Myers, G. Cell detection with star-convex polygons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchmidt%2C+U+%22Medical+Image+Computing+and+Computer+Assisted+Intervention+-+MICCAI+2018%22">Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention - MICCAI 2018</a>. Frangi, A. F., Schnabel, J. A., Davatzikos, A. F., Alberola-López, C., Fichtinger, G. , Springer International Publishing. Cham. 265-273 (2018).</li>
<li>Yoo, T. Y., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((O-GlcNAc+modification+of+nuclear+pore+complexes+accelerates+bidirectional+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">O-GlcNAc modification of nuclear pore complexes accelerates bidirectional transport.</a> J Cell Biol. 220 (7), e202010141(2021).</li>
<li>Jainchill, J. L., Aaronson, S. A., Todaro, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+sarcoma+and+leukemia+viruses%3A+assay+using+clonal+lines+of+contact-inhibited+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Murine sarcoma and leukemia viruses: assay using clonal lines of contact-inhibited mouse cells.</a> J Virol. 4 (5), 549-553 (1969).</li>
<li>Lukinavičius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SiR-Hoechst+is+a+far-red+DNA+stain+for+live-cell+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy.</a> Nat Commun. 6, 8497(2015).</li>
<li>Kudo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptomycin+B+inactivates+CRM1%2Fexportin+1+by+covalent+modification+at+a+cysteine+residue+in+the+central+conserved+region%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Leptomycin B inactivates CRM1/exportin 1 by covalent modification at a cysteine residue in the central conserved region.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (16), 9112-9117 (1999).</li>
<li>Soderholm, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importazole%2C+a+small+molecule+inhibitor+of+the+transport+receptor+importin-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Importazole, a small molecule inhibitor of the transport receptor importin-β.</a> ACS Chem Biol. 6 (7), 700-708 (2011).</li>
<li>Henderson, B. R., Eleftheriou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+activity%2C+sequence+specificity%2C+and+CRM1-dependence+of+different+nuclear+export+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A comparison of the activity, sequence specificity, and CRM1-dependence of different nuclear export signals.</a> Exp Cell Res. 256 (1), 213-224 (2000).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Types+of+nuclear+localization+signals+and+mechanisms+of+protein+import+into+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signaling%22%5BJournal%5D)">Types of nuclear localization signals and mechanisms of protein import into the nucleus.</a> Cell Commun Signaling. 19 (1), 60(2021).</li>
<li>Krueger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+applications+of+optogenetics+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Principles and applications of optogenetics in developmental biology.</a> Development. 146 (20), dev175067(2019).</li>
<li>Kögler, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+rapid+and+reversible+optogenetic+perturbation+of+nuclear+proteins+in+living+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Extremely rapid and reversible optogenetic perturbation of nuclear proteins in living embryos.</a> Dev Cell. 56 (16), 2348-2363 (2021).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hitchhiking+of+Cas9+with+nucleus-localized+proteins+impairs+its+controllability+and+leads+to+efficient+genome+editing+of+NLS-free+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Hitchhiking of Cas9 with nucleus-localized proteins impairs its controllability and leads to efficient genome editing of NLS-free Cas9.</a> Mol Ther. 32 (4), 920-934 (2024).</li>
</ol>

החשיבות של הובלה נוקלאוציטופלזמית (NCT) לוויסות מסלולים תאיים מרכזיים ושמירה על הומאוסטזיס תאי נחקרה היטב במהלך השנים האחרונות1. כתוצאה מכך, נוצרו מספר כלים לחקר הדינמיקה של ה-NCT 2,3,4. בין הכלים הללו, בדיקות אופטוגנטיות LINuS5 ו-LEXY6, שפורסמו בהתאמה ב-2014 ו-2016, מספקות דרך רבת עוצמה לנטר NCT בתאים חיים. כלים אלה, שנועדו לעקוב אחר ייצוא השראה (LEXY) או ייבוא (LINuS) של מדווח פלואורסצנטי, ניתנים להשראה על ידי חשיפה לאור כחול והפיכים.
בקצרה, שתי הבדיקות הקטנות הללו משתמשות בתכונות של תחום LOV2 מהחלבון פוטוטרופין-1 של הצמח Avena sativa7. בהיעדר אור כחול, סליל Jα מתחום LOV2 מצולם ומוטמע בליבת החלבון. מכיוון שסליל Jα יכול להגיב לגירוי אור, הארה על ידי אור כחול גורמת לשינוי קונפורמציה ולניתוק העגינה של סליל Jα מתחום LOV2. המחברים של LEXY ו-LINuS השתמשו ברגישות אור זו כדי להתיך אות לוקליזציה גרעינית (NLS) או אות ייצוא גרעיני (NES) לסליל Jα, עבור LINuS ו-LEXY, בהתאמה (איור 1). הכלי המתקבל הוא בדיקה שעוברת לגרעין (LINuS) או לציטוזול (LEXY) עם תאורת אור כחול.
כדי לעקוב אחר הבדיקות עם הדמיה פלואורסצנטית, נוסף גם מדווח פלואורסצנטי mCherry למבנים. לבסוף, NES חלש (עבור LINuS) או NLS (עבור LEXY) נוסף למערכת כדי להבטיח שהבדיקות לא היו בלוקליזציה הסופית שלהן לפני תאורת האור הכחול, מה שימנע התבוננות בטרנסלוקציה של LEXY או LINuS בין הגרעין לציטוזול.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig1.jpg"> 
איור 1: ייצוג של בדיקות LEXY ו-LINuS. שתי הבדיקות מורכבות מחלבון mCherry המאוחה לתחום LOV2 הרגיש לאור. ההבדל בין שני הכלים טמון ברצף האיתות המוסתר על ידי סליל Jα: NES עבור LEXY ו-NLS עבור LINuS. לשתי הגשושיות יש גם רצף אותות חלש כדי לשלוט בלוקליזציה הראשונית שלהן: NLS חלש עבור LEXY ו-NES חלש עבור LINuS. הפעלת המערכות על ידי תאורת אור כחול גורמת אפוא לייצוא שלהן ל-LEXY או לייבוא שלהן ל-LINuS, מה שמאפשר למשתמשים לפקח על ייצוא או יבוא גרעיני. קיצורים: LEXY = מערכת ייצוא גרעינית הניתנת להשראה אור; LINuS = אות לוקליזציה גרעינית המושרה באור; NLS = אות לוקליזציה גרעינית; NES = אות ייצוא גרעיני. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
הלוקליזציה של הקרינה mCherry מדווחת על העברת בדיקות LEXY ו-LINuS בין גרעינים לציטוזול, ולכן ניתן לעקוב אחריה בהדמיית תאים חיים, מה שמאפשר למשתמשים לנטר NCT. בנוסף לשימוש כבדיקות פשוטות, ניתן להנדס את LEXY ו-LINuS גם כדי לשלוט בלוקליזציה ולחקור חלבונים מעניינים, במבחנה 5,6,8,9 או in vivo 10,11.
שיטת הכימות המוצעת בפרסומי LEXY ו-LINuS מראה את העוצמה הגרעינית היחסית של הגשושיות. הניתוח המוצע נעשה באופן ידני ומסתמך על מדידה של אזור עניין (ROI) בגרעין ובציטוזול. למרות ששיטה זו נותנת ייצוג טוב של אות הגשושית לאורך זמן, היא ארוכה ומייגעת מאוד, במיוחד כאשר ניסויים ותנאים חוזרים על עצמם. חשיבות, שיטה זו גם חסרה דיוק מכיוון שרק חלק קטן מהתא המעוצב מיוצג.
כאן אנו מציעים פרוטוקול חדש לכימות אותות פלואורסצנטיים של LEXY ו- LINuS. יישמנו טכניקות אוטומטיות, המאפשרות את הניתוחים ומספקות דיוק רב יותר. זה יקל על התהליך עבור משתמשים חדשים בכלים אלה ויעזור להגדיל את התפוקה. פרוטוקול הכימות שלנו משתמש בממשק אחד בלבד, תוסף הקוד הפתוח TrackMate12 של FIJI. יש לציין כי כדי לשפר את אמינות הכמות, השתמשנו בסמן DNA אדום רחוק תואם הדמיה חיה כדי לבצע פילוח גרעין שלם עם StarDist13, רשת עצבית קונבולוציונית מאומנת, בשילוב עם מעקב ומדידה של האות הפלואורסצנטי של הגשושית עם TrackMate12.
לאחר מכן ניתן לייצא בקלות את הנתונים המתקבלים לגיליון האלקטרוני המסופק והמוכן לשימוש (טבלה משלימה S1) כדי לקבל את העוצמה הגרעינית היחסית של כל גרעין שזוהה. פרוטוקול זה מסביר גם כיצד לאגד את הערכים המתקבלים בגרף על ידי התאמת עקומת מהלך הזמן המתקבלת למודל חד-מעריכי, כמו ב-Yoo ו-Mitchison14 וכיצד לחשב את קצב ההובלה עבור התנאים השונים שנבדקו. עם פרוטוקול זה והגיליון האלקטרוני המסופק לניתוח, המשתמשים יוכלו לכמת בקלות נתוני הדמיה של תאים חיים, אפילו עם כישורי ביואינפורמטיקה מוגבלים.

<table><tbody><tr><td>קולגן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>לייקה</td><td>SP8</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ג'יבקו</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>הצטיין</td><td>מיקרוסופט</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>פיברונקטין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת פיג'י</td><td>פיג׳י</td><td></td><td>ImageJ 2.16.0/1,54p; Java1.8.0_322</td></tr><tr><td>פלואורוכלים</td><td>דוצ'ר</td><td>FD3510-100</td><td>חלופה: תא אטופלואור (Invitrogen #A7816)</td></tr><tr><td>פריזמה GraphPad 10.4.1</td><td>תוכנת GraphPad, בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Importazole</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>SML0341</td><td></td></tr><tr><td>לפטומיצין B</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L2913</td><td></td></tr><tr><td>פלסמיד LEXY</td><td>אדג'ן</td><td>72655</td><td>pDN122</td></tr><tr><td>פלסמיד LINuS</td><td>אדג'ן</td><td>61347</td><td>pDN77</td></tr><tr><td>עפרון-סטרפטומיצין</td><td>ג'יבקו</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM ללא פנול אדום</td><td>ג'יבקו</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>SiR-DNA</td><td>ספירוכרום</td><td>SC007</td><td>אלטרנטיבה: SPY-DNA650 (ספירוכרום #SC501)</td></tr><tr><td>תוסף Stardist 2D</td><td>סטארדיסט</td><td></td><td>StarDist_0.3.0</td></tr><tr><td>תוסף TrackMate</td><td>טראק מייט</td><td></td><td>TrackMate-7.14.0</td></tr></tbody></table>

שימוש בכלים אופטוגנטיים של lexy ו-linus וניתוח תמונות אוטומטי כדי לכמת דינמיקת הובלה נוקלאוציטופלזמית בתאים חיים

Using LEXY and LINuS Optogenetics Tools and Automated Image Analysis to Quantify Nucleocytoplasmic Transport Dynamics in Live Cells

הפרוטוקול הנ"ל אמור לאפשר למשתמשים לדמיין את הלוקליזציה והטרנסלוקציה של הגשושית במהלך הרכישה בהדמיית תאים חיים. דוגמה לתמונות הצפויות שנרכשו כדי להמחיש את הייצוא הגרעיני עם LEXY מוצגת באיור 4. יש להבחין בירידה מהירה של האות מהגרעין והעשרה בציטוזול לאחר כמה סיבובים של תאורת אור כחול. התאוששות הדרגתית של אות הגשושית יכולה להיות גלויה לאחר עצירת מחזורי התאורה. כדי לשלוט במערכת, Leptomycin B, מעכב ייצוא, מעיד שניתן להמחיש שינוי בייצוא באמצעות הניתוחים, מכיוון שהוא מונע ייצוא של LEXY על תאורת אור כחול (איור 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig4.jpg"> 
איור 4: ויזואליזציה של האות של LEXY לאורך זמן. לכידת נקודות זמן מייצגות של שלבי היציבות, ההארה וההתאוששות, שנרכשו באמצעות הדמיית תאים חיים. מצב המתנול מייצג את מצב הבקרה. עם תאורת אור כחול פועם, באדום, האות הפלואורסצנטי mCherry המדווח על מיקומו של LEXY, מועבר מהגרעין לציטוזול. לאחר הפסקת התאורה, האות מתאושש בגרעין. טיפול במעכב הייצוא Leptomycin B ב-1 ננומטר או 0.5 ננומטר מראה את היעדר או ירידה בייצוא של LEXY כאשר הייצוא נחסם. סרגל קנה מידה = 30 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
לגבי הניתוחים, בעוד שערכי עקומת העוצמה הגרעינית היחסית במהלך הפאזה היציבה צריכים להיות בסביבות 1, לאחר הפעלת האור הכחול, הם צריכים להציג ירידה איטית עד הגעה לרמה בסוף שלב ההארה (איור 5A). אם הירידה מהירה מדי או איטית מדי, ניתן לייעל את פרמטרי הרכישה (ראה דיון). טיפול בלפטומיצין B בריכוזים מספיקים יכול גם לאשר שהניתוחים והטכניקה רגישים מספיק כדי להראות שהיצוא הגרעיני חסום לחלוטין, עם ערכי עוצמה גרעינית יחסית יציבים סביב 1 לכל הניסוי. עם זאת, ריכוזי לפטומיצין B בינוניים אמורים להראות יצוא גרעיני מתון (איור 5A). יש לאשר תצפיות חזותיות אלה באופן כמותי עם התאמת קצב הייצוא (איור 5B).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig5.jpg"> 
איור 5: העוצמה הגרעינית היחסית הצפויה של LEXY וקצב ההובלה. (A) הגרף מייצג את העוצמה הגרעינית היחסית של האות הפלואורסצנטי של LEXY לאורך זמן, מנורמל לעוצמה הממוצעת של mCherry של הפאזה היציבה. העוצמה הגרעינית היחסית של מצב המתנול (בקרה, אדום) יורדת בחצי לאחר ההארה, בניגוד לתאים שטופלו במעכב הייצוא לפטומיצין B, בריכוז של 0.5 ננומטר (כחול בהיר) או 1 ננומטר (כחול כהה). פסי שגיאה: SEM. (B) קצב הייצוא של תנאי הבקרה ולפטומיצין B, המתקבלים על ידי התאמת העקומה למודל חד-מעריכי. הערכים המתקבלים כאשר הייצוא נחסם על-ידי Leptomycin B נמוכים משמעותית ממצב הבקרה. N = 18 תאים למתנול (אדום), 19 תאים ללפטומיצין B 0.5 ננומטר (כחול בהיר) ו-15 תאים ללפטומיצין B 1 ננומטר (כחול כהה). ערכי P חושבו על ידי מבחן t דו-צדדי של וולש. P &lt; 1×10−4, ****: P &lt; 1×10−5.: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה משלימה S1: גיליון אלקטרוני עם חישובים מוגדרים מראש. גיליון אלקטרוני זה מסופק כדי להקל על הניתוח. ניתן להעתיק ולהדביק ישירות את ערכי העוצמה המתקבלים עם TrackMate בגיליון האלקטרוני כדי לקבל את ערכי העוצמה הגרעינית היחסית המנורמלים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/JOVE-Supplemental_Table1.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
טבלה משלימה S2: דוגמה לתוצאות הצפויות עבור מצב בקרה של ניתוח LEXY. הגיליון האלקטרוני מייצג דוגמה לערכים שהתקבלו עבור מצב בקרה של קו התאים היציב של LEXY. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/JOVE-Supplemental_Table2.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>

שימוש בכלים אופטוגנטיים של LEXY ו-LINuS וניתוח תמונות אוטומטי כדי לכמת דינמיקת הובלה נוקלאוציטופלזמית בתאים חיים

Nucleocytoplasmic transport (NCT) is essential for maintaining cellular homeostasis, and its disruption is involved in various diseases, including ...

המעבדה שלנו חוקרת את יחסי הגומלין בין נקבוביות גרעיניות לארגון הכרומטינים. לכן אנו חוקרים כיצד נקבוביות גרעיניות משפיעות על ארגון הכרומטין, אך גם הפוך האם ארגון הכרומטין משפיע על תפקוד הנקבוביות הגרעיניות, במיוחד בהובלה נוקלאוציטופלזמית. הובלה נוקלאוציטופלזמית היא תהליך מהיר מאוד, ולכן אתגר אחד הוא לזהות שינויים בדינמיקה של הובלה נוקלאוציטופלזמית בתאים חיים.אין הרבה כלים זמינים לניטור הובלה נוקלאוציטופלזמית בתאים חיים. על ידי יישום טכניקה חצי אוטומטית ומשופרת, אנו מקווים להקל על השימוש בכלים אלה. הפרוטוקול שלנו מבוסס על למידה עמוקה.זה מגביל את השגיאות ומפחית מאוד את הזמן הדרוש לניתוח. מה שבעבר היה לוקח יום לוקח עכשיו רק שעה או שעתיים. כדי להתחיל, הפעל את תוכנת FIJI במערכת המחשב.בחר את השלב היציב כתמונה אחת, את שלב ההארה כתמונה שתיים, ואת שלב השחזור כתמונה שלוש. שרשר את שלושת התמונות המייצגות שלושה שלבים ליצירת תמונה אחת. שמור את התמונה הממוזגת שהתקבלה לצורך פילוח על-ידי ניווט אל קובץ ובחירה באפשרות שמור כ- TIFF.לאחר מכן, פצל את ערוץ mCherry על-ידי בחירה בערוצים תמונה, צבע ופיצול. לאחר מכן שמור את התמונה המפוצלת על ידי מעבר אל קובץ, שמירה בשם ו-TIFF. כדי לבדוק אם יש הלבנה במהלך הרכישה, בחרו ברצף Image, Stacks ו-Plot Z-axis Profile.לאחר מכן לחץ על נתונים, ואחריו העתק מערך נתונים ראשון, והדבק אותו בגיליון האלקטרוני המצורף תחת תא פרופיל ציר Z. כעת צייר אזור עניין מעגלי, בקירוב הגודל הממוצע של גרעין, על ידי לחיצה על ניתוח, ואחריו כלים ולחיצה על מנהל החזר ההשקעה. הוסף את ההחזר על ההשקעה ושמור אותו על ידי ניווט אל עוד ולחיצה על שמור.מקם את ההחזר על ההשקעה שנשמר באזור נטול תאים במהלך קיטועי הזמן. ודא שערך אפור ממוצע "נבחר תחת נתח והגדר מדידות. לאחר מכן לחץ על עוד, רב מדידה.בדוק למדוד את כל 50 הפרוסות "והחזר השקעה אחד לכל פרוסה" ולחץ על אישור כדי לתעד את העוצמה. העתק והדבק את כל ערכי העוצמה הנמדדים בגיליון האלקטרוני המצורף תחת תא הרקע של החזר ההשקעה. לאחר מכן סגור את התמונה עם ערוץ mCherry בלבד ובחר את התמונה שנשמרה עם ערוצים ממוזגים.כעת פתח את התוסף TrackMate על ידי לחיצה רציפה על תוספים, מעקב ו- TrackMate. ודא שנקודות הזמן נעות בין אפס ל- 49 ולחץ על הבא. בחר את גלאי StarDist ולחץ על הבא.בחר ערוץ שני, SiR-DNA, לפילוח גרעינים והמתן להשלמת התהליך. השאר את פרמטרי ברירת המחדל בחלון הסף ולחץ על הבא. צור מסננים באמצעות עוצמה ממוצעת, ערוץ ראשון, כדי לא לכלול גרעינים עם ערכי אות קיצוניים.צור מסנן אחד לבחירת ערכים מעל הסף המוגדר והשני לבחירת הערכים מתחת לסף. באופן דומה, הוסף שני מסנני שטח להסרת פסולת או תאים גוססים ולחץ על הבא. בחר את גשש ה-LAP הפשוט ולחץ על הבא.לאחר מכן, התאם את פרמטרי המעקב. הגדר את המרחק המקסימלי של הקישור" ל-30 מיקרומטר, את המרחק המקסימלי לסגירת הפער "ל-15 מיקרומטר, ואת פער המסגרת המקסימלי של סגירת הפער" לשלושה. לאחר מכן לחץ על הבא.לאחר החישובים, לחץ על הבא כדי להגדיר מסננים במסלולים. כדי לבחור רק גרעינים שהיו במעקב במהלך כל מסלול הזמן, בחר את המספר הגבוה ביותר של נקודות במסלול ולחץ על הבא. לאחר מכן סמן את שמות נקודות התצוגה", כדי לשחזר כל גרעין בניתוחים נוספים ולהתאים אישית תכונות תצוגה אחרות לפי העדפתך.בתחתית הדף, לחץ על רצועות ובחר ייצוא ל-CSV"כדי לשמור את טבלת המדידה. סגור את הטבלה והמשך על-ידי לחיצה על הבא. כעת לחץ על לכידה"כפעולה, ולאחר מכן לחץ על ביצוע, ואחריו אישור כדי ליצור תמונה עם גרעינים במעקב.שמור את התמונה על ידי לחיצה רציפה על קובץ, שמירה בשם ובחירה ב-TIFF. כדי לייבא את קובץ ה-CSV של TrackMate לגיליון האלקטרוני המצורף, לחץ על הכרטיסייה נתונים. תחת הקבוצה קבל נתוני המרה", לחץ על מטקסט/CSV" ולחץ על ייבוא.העתק את העמודות Spot IDB, Track IDC, Frame I ועוצמה ממוצעת ערוץ 1M, והדבק בעמודות A עד D של הגיליון האלקטרוני המצורף. מיין את התוצאות בסדר אלפביתי תחילה לפי מזהה מסלול, גרעין בודד, מתא B5, ולאחר מכן לפי מסגרת, נקודת זמן, מתא C5. כעת פתח את GraphPad Prism, צור גיליון חדש והעתק-הדבק את עמודת הזמן מהגיליון האלקטרוני. לאחר מכן הדבק את הערכים המתקבלים כעוצמה גרעינית יחסית בטבלת GraphPad Prism.כדי ליצור את גרף העוצמה הגרעינית היחסית, נווט אל הקטע גרף ובחר XY כמשפחת הגרפים. לאחר מכן בחר נקודות וקו חיבור עם פסי שגיאה"כסוג הגרף. בהגדרות העלילה, בחר Mean and Error" ו- SEM ולחץ על OK. לאחר מכן, כדי להשיג את קצב הייצוא, לחץ על טבלת נתונים חדשה והזן את הזמנים בעשרוניים רק עבור שלבים יציבים ותאורה.הדבק את הערכים המתקבלים כעוצמה גרעינית יחסית עבור שלבים אלה בטבלה. בקטע תוצאות, לחץ על ניתוח XY ואחריו אקספוננציאלי. לאחר מכן בחרו רגרסיה לא ליניארית ולחצו על הלחצן 'אשר'. בחר רמה ואחריה דעיכה פאזה אחת"כמודל תחת הפרמטרים.לאחר מכן בחר קבוע השווה ל- 2.25 כ- X0, קבוע השווה ל- 1 כ- Y0 וקבוע השווה לאפס עבור הרמה. ציין ש- K צריך להיות גדול מאפס ולחץ על אישור. צור טבלה חדשה והדבק ובצע חילוף של ערכי K שהתקבלו. במקטע Graph, בחר Column כמשפחת הגרפים ובחר את תרשים הכינור כסוג הגרף.בחר הצג את כל הנקודות"כתרשים ולחץ על אישור. ייצוא גרעיני עם לקסי הבדיקה האופטוגנטית הודגם בהדמיית תאים חיים. במצב הביקורת עם תאים שטופלו במתנול, עוצמת ה-mCherry הגרעיני ירדה בחדות לאחר תאורת אור כחול, ואחריה התאוששות הדרגתית בשלב שלאחר ההארה. הטיפול במעכב הייצוא, לפטומיצין B, גרם לשינוי בייצוא הגרעיני, שכן אות הגשושית נשאר גרעיני באופן עקבי לאורך כל נקודות הזמן.ניתוח כמותי של עוצמת הגרעין היחסית הראה לאורך זמן ירידה איטית עד שהגיעה לרמה בסוף שלב ההארה. ריכוזי לפטומיצין B בינוניים אמורים להראות יצוא גרעיני מתון. שיעורי הייצוא שחושבו מנתוני העוצמה אישרו שיעור יצוא גבוה משמעותית בתאים שטופלו במתנול, שיעור נמוך בהרבה עם 0.5 ננו-מולרי לפטומיצין B, וכמעט ללא ייצוא בלפטומיצין B ננו-מולרי אחד.

using-lexy-linus-optogenetics-tools-automated-image-analysis-to

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מיקרוסקופיה מולקולה בודדת approch סיפק תובנות הרומן לתוך התחבורה גרעיני.

מולקולה בודדת הדמיה התחבורה גרעיני

הובלה תוך-תאית של מטענים, כגון שלפוחיות או אברונים, מתבצעת על ידי חלבונים מוטוריים מולקולריים העוקבים אחר מיקרו-צינורות מקוטבים. פרוטוקול זה מתאר את המתאם בין כיווניות ההובלה של חלקיקי מטען בודדים הנעים בתוך נוירונים, לכמות היחסית והסוג של חלבונים מוטוריים קשורים.

ניתוח &quot;מטען מיפוי&quot; המאפיין את ההרכב מולקולרי מוטורס על העברת axonal מטענים שימוש

טכניקות מיקרוסקופ אור בשילוב עם מבחנים ביוכימיים מבהירים את המעורבות של אקסוציטוזיס בתיווך SNARE בהסתעפות אקסונים תלויי נטרין. שילוב טכניקות זה מאפשר זיהוי של מנגנונים מולקולריים השולטים בהסתעפות האקסון ובשינוי צורת התא.

ניצול מתודולוגיות משולב להגדיר את התפקיד של משלוח ממברנה פלזמה במהלך אקסון מסעף ו העצבית המורפוגנזה

החקירה של סחר קרום הוא חיוני להבנת תפקודים נוירונים. כאן, אנו מציגים שיטה לכימות תנועתיות שלפוחית ​​נוירונים. זוהי שיטה נוחה שניתן להתאים את כימות של סחר קרום במערכת העצבים.

כימות של Endosome ו Lysosome Motilities ב נוירונים תרבותיים באמצעות בדיקות פלואורסצנטי

פרוטוקול זה מתאר שיטה רגיש למדוד את קצב ההעברה nucleocytoplasmic בתוך נוירון כמו NSC-34 תאים תאים על ידי כימות השינוי בזמן אמת ביבוא גרעיני של חלבון NLS-NES-GFP.

Assay למדוד Nucleocytoplasmic התחבורה בזמן אמת בתוך מוטורי נוירון כמו NSC-34 תאים

Caenorhabditis elegans (C. elegans) הוא מודל טוב ללמוד תחבורה עצב, תאיים. . הנה, אני מתארת פרוטוקול ויוו הקלטה וניתוח התחבורה עצב, intraflagellar C. elegans.

קיבעון של Caenorhabditis elegans לנתח להובלה תאיים בנוירונים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתח-לתא בהעברת מידע מתנדנדות על ידי שליטה optogenetic ולחיות ניטור של ביטוי גנים. גישה זו מספקת פלטפורמה ייחודית לבחון את משמעות תפקודית של תוכניות ביטוי גנים דינמי במערכות רב תאיים.

שיטת Optogenetic לשלוט ולנתח ג'ין תבניות ביטוי באינטראקציות לתא

באמצעות עכברים פלואורסצנטיים מהונדסים, מתוארים פרוטוקולים מפורטים להערכת הובלה אקסונאלית in vivo של אנדוזומים איתות ומיטוכונדריה בתוך אקסונים מוטוריים וחושיים של העצב הסיאטי השלם בחיות חיות.

הרחבת ערכת הכלים להדמיית In Vivo של תחבורה אקסונלית

כאן, אנו מדגימים כיצד לשלב טרנספקציה של נוירונים מכרסמים ראשוניים בהיפוקמפוס עם הדמיה קונפוקלית של תאים חיים כדי לנתח השפעות פתולוגיות המושרות על ידי חלבונים על הובלה אקסונלית ולזהות מסלולים מכניסטיים המתווכים השפעות אלה.

שימוש בדימות תאים חיים כדי למדוד את ההשפעות של חלבונים פתולוגיים על תחבורה אקסונלית בנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס

המאמר מתאר אופטימיזציה של פרמטרים לרכישת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי להמחיש את ההובלה האקסונלית של מטענים מסומנים אנדוגניים ברזולוציה של נוירון יחיד בנמטודה חיה.

אופטימיזציה של ויזואליזציה של הובלה אקסונלית של מטען אנדוגני על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב Caenorhabditis elegans חי

למדו שימוש בכלים אופטוגנטיים לניתוח אוטומטי של הובלה נוקלאוציטופלזמית בתאים חיים. פרוטוקול זה מציג גישה חדשנית לחקר מנגנוני תחבורה תאוניים בביולוגיה.

שימוש בכלים אופטוגנטיים של LEXY ו-LINuS וניתוח תמונות אוטומטי כדי לכמת דינמיקת הובלה נוקלאוציטופלזמית בתאים חיים

גלה סרטונים נוספים