שימוש בכלים אופטוגנטיים של LEXY ו-LINuS וניתוח תמונות אוטומטי כדי לכמת דינמיקת הובלה נוקלאוציטופלזמית בתאים חיים

המעבדה שלנו חוקרת את יחסי הגומלין בין נקבוביות גרעיניות לארגון הכרומטינים. לכן אנו חוקרים כיצד נקבוביות גרעיניות משפיעות על ארגון הכרומטין, אך גם הפוך האם ארגון הכרומטין משפיע על תפקוד הנקבוביות הגרעיניות, במיוחד בהובלה נוקלאוציטופלזמית. הובלה נוקלאוציטופלזמית היא תהליך מהיר מאוד, ולכן אתגר אחד הוא לזהות שינויים בדינמיקה של הובלה נוקלאוציטופלזמית בתאים חיים.

אין הרבה כלים זמינים לניטור הובלה נוקלאוציטופלזמית בתאים חיים. על ידי יישום טכניקה חצי אוטומטית ומשופרת, אנו מקווים להקל על השימוש בכלים אלה. הפרוטוקול שלנו מבוסס על למידה עמוקה.

זה מגביל את השגיאות ומפחית מאוד את הזמן הדרוש לניתוח. מה שבעבר היה לוקח יום לוקח עכשיו רק שעה או שעתיים. כדי להתחיל, הפעל את תוכנת FIJI במערכת המחשב.

בחר את השלב היציב כתמונה אחת, את שלב ההארה כתמונה שתיים, ואת שלב השחזור כתמונה שלוש. שרשר את שלושת התמונות המייצגות שלושה שלבים ליצירת תמונה אחת. שמור את התמונה הממוזגת שהתקבלה לצורך פילוח על-ידי ניווט אל קובץ ובחירה באפשרות שמור כ- TIFF.

לאחר מכן, פצל את ערוץ mCherry על-ידי בחירה בערוצים תמונה, צבע ופיצול. לאחר מכן שמור את התמונה המפוצלת על ידי מעבר אל קובץ, שמירה בשם ו-TIFF. כדי לבדוק אם יש הלבנה במהלך הרכישה, בחרו ברצף Image, Stacks ו-Plot Z-axis Profile.

לאחר מכן לחץ על נתונים, ואחריו העתק מערך נתונים ראשון, והדבק אותו בגיליון האלקטרוני המצורף תחת תא פרופיל ציר Z. כעת צייר אזור עניין מעגלי, בקירוב הגודל הממוצע של גרעין, על ידי לחיצה על ניתוח, ואחריו כלים ולחיצה על מנהל החזר ההשקעה. הוסף את ההחזר על ההשקעה ושמור אותו על ידי ניווט אל עוד ולחיצה על שמור.

מקם את ההחזר על ההשקעה שנשמר באזור נטול תאים במהלך קיטועי הזמן. ודא שערך אפור ממוצע "נבחר תחת נתח והגדר מדידות. לאחר מכן לחץ על עוד, רב מדידה.

בדוק למדוד את כל 50 הפרוסות "והחזר השקעה אחד לכל פרוסה" ולחץ על אישור כדי לתעד את העוצמה. העתק והדבק את כל ערכי העוצמה הנמדדים בגיליון האלקטרוני המצורף תחת תא הרקע של החזר ההשקעה. לאחר מכן סגור את התמונה עם ערוץ mCherry בלבד ובחר את התמונה שנשמרה עם ערוצים ממוזגים.

כעת פתח את התוסף TrackMate על ידי לחיצה רציפה על תוספים, מעקב ו- TrackMate. ודא שנקודות הזמן נעות בין אפס ל- 49 ולחץ על הבא. בחר את גלאי StarDist ולחץ על הבא.

בחר ערוץ שני, SiR-DNA, לפילוח גרעינים והמתן להשלמת התהליך. השאר את פרמטרי ברירת המחדל בחלון הסף ולחץ על הבא. צור מסננים באמצעות עוצמה ממוצעת, ערוץ ראשון, כדי לא לכלול גרעינים עם ערכי אות קיצוניים.

צור מסנן אחד לבחירת ערכים מעל הסף המוגדר והשני לבחירת הערכים מתחת לסף. באופן דומה, הוסף שני מסנני שטח להסרת פסולת או תאים גוססים ולחץ על הבא. בחר את גשש ה-LAP הפשוט ולחץ על הבא.

לאחר מכן, התאם את פרמטרי המעקב. הגדר את המרחק המקסימלי של הקישור" ל-30 מיקרומטר, את המרחק המקסימלי לסגירת הפער "ל-15 מיקרומטר, ואת פער המסגרת המקסימלי של סגירת הפער" לשלושה. לאחר מכן לחץ על הבא.

לאחר החישובים, לחץ על הבא כדי להגדיר מסננים במסלולים. כדי לבחור רק גרעינים שהיו במעקב במהלך כל מסלול הזמן, בחר את המספר הגבוה ביותר של נקודות במסלול ולחץ על הבא. לאחר מכן סמן את שמות נקודות התצוגה", כדי לשחזר כל גרעין בניתוחים נוספים ולהתאים אישית תכונות תצוגה אחרות לפי העדפתך.

בתחתית הדף, לחץ על רצועות ובחר ייצוא ל-CSV"כדי לשמור את טבלת המדידה. סגור את הטבלה והמשך על-ידי לחיצה על הבא. כעת לחץ על לכידה"כפעולה, ולאחר מכן לחץ על ביצוע, ואחריו אישור כדי ליצור תמונה עם גרעינים במעקב.

שמור את התמונה על ידי לחיצה רציפה על קובץ, שמירה בשם ובחירה ב-TIFF. כדי לייבא את קובץ ה-CSV של TrackMate לגיליון האלקטרוני המצורף, לחץ על הכרטיסייה נתונים. תחת הקבוצה קבל נתוני המרה", לחץ על מטקסט/CSV" ולחץ על ייבוא.

העתק את העמודות Spot IDB, Track IDC, Frame I ועוצמה ממוצעת ערוץ 1M, והדבק בעמודות A עד D של הגיליון האלקטרוני המצורף. מיין את התוצאות בסדר אלפביתי תחילה לפי מזהה מסלול, גרעין בודד, מתא B5, ולאחר מכן לפי מסגרת, נקודת זמן, מתא C5. כעת פתח את GraphPad Prism, צור גיליון חדש והעתק-הדבק את עמודת הזמן מהגיליון האלקטרוני. לאחר מכן הדבק את הערכים המתקבלים כעוצמה גרעינית יחסית בטבלת GraphPad Prism.

כדי ליצור את גרף העוצמה הגרעינית היחסית, נווט אל הקטע גרף ובחר XY כמשפחת הגרפים. לאחר מכן בחר נקודות וקו חיבור עם פסי שגיאה"כסוג הגרף. בהגדרות העלילה, בחר Mean and Error" ו- SEM ולחץ על OK. לאחר מכן, כדי להשיג את קצב הייצוא, לחץ על טבלת נתונים חדשה והזן את הזמנים בעשרוניים רק עבור שלבים יציבים ותאורה.

הדבק את הערכים המתקבלים כעוצמה גרעינית יחסית עבור שלבים אלה בטבלה. בקטע תוצאות, לחץ על ניתוח XY ואחריו אקספוננציאלי. לאחר מכן בחרו רגרסיה לא ליניארית ולחצו על הלחצן 'אשר'. בחר רמה ואחריה דעיכה פאזה אחת"כמודל תחת הפרמטרים.

לאחר מכן בחר קבוע השווה ל- 2.25 כ- X0, קבוע השווה ל- 1 כ- Y0 וקבוע השווה לאפס עבור הרמה. ציין ש- K צריך להיות גדול מאפס ולחץ על אישור. צור טבלה חדשה והדבק ובצע חילוף של ערכי K שהתקבלו. במקטע Graph, בחר Column כמשפחת הגרפים ובחר את תרשים הכינור כסוג הגרף.

בחר הצג את כל הנקודות"כתרשים ולחץ על אישור. ייצוא גרעיני עם לקסי הבדיקה האופטוגנטית הודגם בהדמיית תאים חיים. במצב הביקורת עם תאים שטופלו במתנול, עוצמת ה-mCherry הגרעיני ירדה בחדות לאחר תאורת אור כחול, ואחריה התאוששות הדרגתית בשלב שלאחר ההארה. הטיפול במעכב הייצוא, לפטומיצין B, גרם לשינוי בייצוא הגרעיני, שכן אות הגשושית נשאר גרעיני באופן עקבי לאורך כל נקודות הזמן.

ניתוח כמותי של עוצמת הגרעין היחסית הראה לאורך זמן ירידה איטית עד שהגיעה לרמה בסוף שלב ההארה. ריכוזי לפטומיצין B בינוניים אמורים להראות יצוא גרעיני מתון. שיעורי הייצוא שחושבו מנתוני העוצמה אישרו שיעור יצוא גבוה משמעותית בתאים שטופלו במתנול, שיעור נמוך בהרבה עם 0.5 ננו-מולרי לפטומיצין B, וכמעט ללא ייצוא בלפטומיצין B ננו-מולרי אחד.