מיקרוסקופ התרחבות: הדמיה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה עם מיקרוסקופ קונבנציונלי

אנחנו ביולוגים של תאים החוקרים את תפקיד המיקרוטובול ואת תפקידם הנלווה באורגניזמים מודליים שונים. מטרתנו לחקור את תפקידם בארגון התאים, מורפוגנזה, ציליוגנזה וחלוקה. בחמש השנים האחרונות תרמנו להבנת ההרכב המולקולרי המעגלי, במיוחד באמצעות מיקרוסקופ התרחבות.

ובכך אנו חושפים את המאפיין המרכזי של ההרכבה והפונקציה שלהם. על ידי שילוב מיקרוסקופ הרחבה עם קריופקסציה, הפרוטוקול שלנו מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה תוך שמירה על המבנה הקרוב הטבעי של האלמנט התאי, מה שמתגבר על המגבלה העיקרית של מיקרוסקופיה ברזולוציה על. אז מיקרוסקופיית הרחבה, זו טכניקה זולה וקלה ליישום שמעניקה גישה לכל המעבדה ברזולוציה גבוהה.

כדי להתחיל, השתמש במזרק ובמחט כדי למלא כל צינור של חמישה מיליליטר במיליליטר אחד של אצטון יבש נוסף מתחת למכסה כימיקלי. הנח את הצינורות זקופים במתקן מתכת ושים אותם בחנקן נוזלי להקפאה. מלאו חצי מארגזת פוליסטירן בעובי 30 על 30 סנטימטרים בקרח יבש, ואז מלאו את הדוור מסוג ויטרובוט בחנקן נוזלי עד שההתאדות מפסיקת.

כעת, הסר את העכביש ממכשיר הצלילה ומלא את תא הטבילה המתכתי באתאן נוזלי. המתינו 10 דקות כדי לאפשר לאתאן להגיע לשיווי משקל. לאחר מכן, קחו כיסוי 12 מ"מ עם פינצטה דקה וטפחו על נייר טישו כדי לספוג עודפי מדיום מהכיסוי.

החזק את הכיסוי למחצה, באמצעות פינצטה המצוידת בטבעת הידוק התואמת לבוכנת הקריו. הנח את הפינצטה שמחזיקה את הכיסוי בתוך מחזיק הבוכנה הקריו-פלנגרס, והשתמש בנייר ווטמן כדי למחוק כל חומר שנותר. הפעל את הבוכנה הקריומטרית כדי להכניס את הכיסוי לתמיסת האתאן שבתא המתכת.

לאחר מכן, העבר במהירות את הכיסוי לצינור המכיל אצטון קפוא. דגרו את הצינורות המכילים את הכיסוי בקרח יבש בזווית של כ-45 מעלות. הניחו את המיכל הסגור על רועיד מסלול שמוגדר על 50 עד 100 סל"ד, וערבבו לילה בארבע מעלות צלזיוס כדי לאפשר לטמפרטורה לעלות בהדרגה.

לאחר מכן, הסר את רוב הקרח היבש מהקופסה. המשיכו בערבוב על הרעידת המסלול עוד 45 דקות כדי לאפשר לטמפרטורה לעלות ממינוס 80 מעלות צלזיוס למינוס 20 מעלות צלזיוס. פתח וסגר בקצרה כל צינור כדי לשחרר לחץ פנימי.

לאחר מכן, העבירו כל כיסוי ללוח של 12 בארות או למיכל מתאים שמולא מראש בתמיסת אתנול 100% מקוררת מראש. לאחר דגירה של חמש דקות, יש להחזיר את הכיסוי דרך סדרת אתנול מדורגת. לאחר העברת הכיסוי ל-PBS, מניחים אותם תחת מיקרוסקופ.

השתמש בפינצטה עדינה כדי לגרד בעדינות את המשטח ולכוון את כל הכיסוי כשהצד הנכון פונה כלפי מעלה. הניחו את הכיסוי לפלטה בת ארבע בארות הממולאת ב-0.5 עד מיליליטר אחד של תמיסת 2% אקרילאמיד ו-1.4% פורמלדהיד ב-PBS. לאחר מכן דגרו את הכיסוי בתמיסה זו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ללא ערבוב.

לאחר מכן, הפשיר 10% APS ואת תמיסת הג'לציה על קרח במשך 10 דקות לפני הג'ל. הכינו תא לח באמצעות שכבה דקה של רקמה רטובה ופארפילם. ואז אחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר 10 דקות, מניחים את התא הלח על גוש קר לשימוש במהלך הג'לציה. כעת, הסר את הכיסוי מתמיסת העיגון של החלבון ומנגב נוזלים עודפים באמצעות נייר טישו בשני מעברים רצופים. הוסיפו APS לתמיסת הג'לציה כדי להגיע לריכוז סופי של 0.5% ומערבולת למשך שניות עד שלוש.

לאחר מכן, יש פיפטה עם שתי טיפות של 35 מיקרוליטר על הפרפילם בתא הלח ומניח בעדינות כל כיסוי מעל טיפה, כאשר התאים פונים כלפי מטה אל תוך תמיסת הג'לציון. העבר את התא הלח לאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 60 דקות. לדנאטורציה, השתמשו בכלי ניקוב ביופסיה בקוטר 0.4 סנטימטר לחילוץ חתיכות ג'ל, והניחו אותן בלוח עם שישה בארות מלא במיליליטר אחד של בופר דנאטורציה.

ערבבו את הפלטה במשך 10 עד 15 דקות, עד שהג'לים מתנתקים מהכיסוי, והעבירו את חלקי הג'ל המנותקים לצינורות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר מלאים בבופר דנאטורציה טרי. דגרו את הג'לים למשך 90 דקות בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, העבר את הג'לים למים מזוקקים כפול למשך 10 דקות לכביסה.

מדדו את קוטר הג'לים באמצעות נייר מילימטר כדי להעריך את גורם ההתפשטות של הג'ל. כיסוי כיסוי נקי עם כ-200 מיקרוליטר של תמיסת פוליליזין. דגרו את הכיסויים למשך שעה בטמפרטורת החדר, ואז שטפו אותן שלוש פעמים במים מזוקקים כפול כדי להסיר פוליליזין עודף.

לאחר שהכיסוי יבש, אחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. הנח את הג'ל בכיוון הנכון, כשהתאים פונים כלפי מעלה, על נייר ללא סיבים ותן להם להתייבש כדי להוציא מים עודפים. לבסוף, התקן את הג'לים היבשים כשהתאים פונים כלפי מטה על כיסויי כיסוי מצופים פולי-די-ליזין.

קריופיקסציה שימרה את רשת המיטוכונדריה בתאי RPE1 בצורה יעילה יותר מאשר קיבוע PFA, כפי שהודגם בצביעת אסטר ו-ATP5A של NHS, ואפשרה פתרון הקריסטות המיטוכונדריאליות, שלא היו נראות בקיבוע PFA. קריופיקסציה הביאה לשימור טוב יותר של מיקרוטובולים דינמיים, כולל מיקרוטובולים ציטופלזמיים ואסטרליים בתאי RPE1 מיטוטיים, בהשוואה לקיבוע PFA. טריפנוזומה ברוסיי, קריופיקסציה שימרה טוב יותר את ארכיטקטורת המיטוכונדריה והמבנה התא הכללי בהשוואה לקיבוע PFA, כפי שהודגם בצביעת אסטר של TDH ו-NHS.

בנוסף, קריופקסציה שימרה את הרשתית האנדופלזמית טוב יותר מאשר קיבוע PFA המבוסס על צביעת BIP. נצפו סדקים בתאי RPE1 מוקפדים בקריופיקס, אך הם לא הפריעו למבנה האולטרה של האברונים, כגון מיטוכונדריה או מיקרוטובולים. קריופיקסציה לקויה דוברה על ידי מבנים דמויי בועות ומיקרוטובולים גליים, מלווה באובדן שלמות האברונים הקברניים.

איכות ההתרחבות הייתה תלויה בשקיפות תמיסות הנתרן האקרילט, כאשר תמיסות שמישות נראו חסרות צבע או צהובות ושקופות במקצת, בעוד שהתמיסות הבלתי שמישות נראו עכורות וכתומות.