תיוג בתאי גזע עם צבעי ניאון על איתור פולשני עם דימות אופטי

ברוכים הבאים למעבדה של ד"ר Hiku Alge Blink. אנו מבקשים להודות למכון קליפורניה לרפואה רגנרטיבית על מימון פרויקט זה. סימון תאי גזע באמצעות חומר ניגוד פלואורסצנטי מאפשר מעקב in vivo אחר תאי גזע מושתלים in vivo.

דימוג אופטי עוקב של התאים הגזעיים המסומנים מאפשר מחקרים אורכיים שבהם ניתן לנטר באופן לא פולשני את נדידת התאים in vivo. סרטון זה יראה לכם כיצד לסמן הן תאי גזע עובריים אנושיים והן תאי גזע מזנכימליים אנושיים באמצעות צבעים פלואורסצנטיים. שלום, אני סופי בודינגטון מקבוצת המחקר של חומרי ניגוד במחלקה לרדיולוגיה באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו.

היום אני מעוניין להראות לכם שתי טכניקות שונות לסימון תאי גזע באמצעות חומרי ניגוד פלואורסצנטיים. אחת לסימון תאי גזע מזנכימליים עם הצבע הפלואורסצנטי, DID, ואחרת לסימון תאי גזע עובריים אנושיים עם endign ingra. אז הרשו לי להתחיל ולהראות לכם את הטכניקה שלנו לסימון תאי גזע מזנכימליים אנושיים באמצעות DID.

כדי להתחיל בהליך הסימון של תאי גזע מזנכימליים, עלינו לנתח ולספור אותם כדי להגיע לסספנסיה עם מספר תאים מוגדר. מכיוון שמדובר בטכניקה סטנדרטית של תרבית רקמות, לא נציגה אותה בפירוט. אנו מעוניינים להסבי את התאים שנסמן בצפיפות של 1 מיליון תאים למיליליטר במצע תרבית נטול סרום.

ראשית, נוסיף 5 µL של חומר ניגוד DID לכל 1 mL של תרחיף תאים. כעת נערבב את התמיסה באמצעות פיפטאג עדין. התאים מדוגרים עם תמיסת הסימון בצלחת בעלת 6 בארות עם הידבקות נמוכה (low attachment) בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות. עם סיום הדגירה הפשוטה, נעביר כעת את תמיסת התאים למבחנה לצנטריפוגה בנפח 15 mL.

אנו סובבים את הדגימה בצנטריפוגה ב-400 RCF למשך חמש דקות. לאחר מכן, אנו שואבים החוצה את מדיום הסימון תוך כדי הקפדה שלא להפריע למשקע. כעת אנו שוטפים את התאים עם PBS.

אנו שואבים ופורקים את התאים עם פיפטה, תוךما וודאות שמשקיע התאים התפרק. אנו חוזרים על שני השלבים האחרונים פעמיים נוספות, כך שיהיו לנו סך הכל שלושה שלבי שטיפה.

כעת נספור את התאים ונבצע בדיקת trypan blue כדי לקבוע את חיוניות התאים. לאחר קביעת חיוניות התאים, התאים מוכנים כעת להדמיה במכשיר ההדמיה האופטי. כדי להתחיל את תהליך הסימון של תאי גזע עובריים אנושיים, עלינו להכין תחילה את חומר הניגוד המכונה Indocyanine Green.

לאחר מכן, אנו מערבבים זאת עם חומר הטרנספקציה המכונה פרוטמין. ראשית, אנו מודדים 1 mg של אבקת indocyanine green וממסים אותה ב-100 µL של DMSO. אנו מוסיפים לתערובת 400 µL של DMEM המכיל 10% FCS ומערבבים היטב, מה שמותיר לנו ריכוז של 2 mg/mL של indocyanine green.

בשלב הבא, אנו מוסיפים את חומר הטרנספקציה פרוטמין, המשמש כהסעה עבור חומר הניגוד ומאפשר לו להיכנס לתא ביעילות רבה יותר. כעת נערבב 5 µL של protamine sulfate בריכוז של 10 mg/mL עם 300 µL של ICG ו-300 µL של DMEM ללא סרום. כעת ננער את תמיסת הטרנספקציה החדשה במשך חמש דקות כדי לאפשר היווצרות של קומפלקסים.

בשלב הבא, נשאב את המצע הישן ונוסיף לתאים 10 milliliters של DMEM שחומם מראש. נוסיף לתאים את תמיסת ה-protamine ICG שהוכנה קודם לכן, ונחיל דגירה של שעה אחת על ידי הנחת הצלחית באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C. עם סיום הדגירה, נוציא את הצלחית מהאינקובטור, נשאב את תמיססת הסימון ונשטוף את התאים על ידי שטיפת הצלחית עם חמישה milliliters של PBS.

לאחר מכן, התאים עוברים עיבוד בטריפסין למשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 °C. ניעור של הכלי יסייע בהרחפת התאים. כעת נבצע פיפטור עדין למעלה ולמטה כדי לפרק את המושבות שנותרו.

אנו מנטרלים את ה-trypsin על ידי הוספת כמות שווה של DMEM המכיל 10%FCS לצלוחית. לאחר מכן, אנו מעבירים את תמיסת התאים לפיתלה של 15 מיליליטר וסובבים את התמינה בצנטריפוגה ב-400 RCF למשך חמש דקות. אנו מרחפים מחדש את התאים במצע גידול מלא.

כעת ניתן להסיר גושים או קומפלקסים ששאירו על ידי העברת התאים דרך מסנן תאים של 40 µm. ברגע שיש לנו תמיסת תאים ללא גושים, נשאב החוצה את המצע הישן ונשחיה מחדש את המשקע במצע תאי גזע עובריים אנושיים מלא שחומם מראש. בשלב זה, עלינו להפריד את תאי המזין של העכבר מתאי הגזע העובריים האנושיים.

פעולה זו מבוצעת כדי להבטיח שבהמשך נדמה רק את תאי הגזע. לשם כך, אנו מעבירים את תמיסת התאים לצלחית פטרי בקוטר 10 סנטימטרים מצופה ג'לטין. אנו מכניסים את הצלחית לאנקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות ומניחים לה לעמוד במשך 45 דקות.

במהלך זמן זה, יש להקפיד לא להפריע לצלחת. כעת תאי המזינים (feeders) יידבקו לצלחת, בעוד שתאי הגזע לא יידבקו. אנו מעבירים את התמיסה אל מחוץ לצלחת הפטרי, וכעת יש בידינו תמיסה מסומנת של תאי גזע עובריים אנושיים בודדים.

כעת ניתן לספור את התאים ולבצע עליהם בדיקת trypan blue. לאחר אישור החיוניות, התאים שלנו מוכנים להדמיה. השקופית מראה דוגמה לאופן שבו ניתן להדמות תאי גזע in vivo בעכברים לאחר שסומנו בחומר ניגוד פלואורסצנטי והוחדרו באמצעות הזרקה IP.

סריקות דימוי אופטי סדרתיות הראו הצטברות ראשונית של התאים בריאות, ולאחריה פיזור מחדש בכבד, במח העצמות של הגפיים ובבלוטת התריס. ניתן להשתמש בסימון הפלואורסצנטי גם להצגה ישירה של תאי גזע מושתלים בדגימות היסטופתולוגיות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. הרגע הצגנו לכם כיצד לסמן תאי גזם באמצעות חומרי ניגודיות פלואורסצנטיים בעת ביצוע סימון תאים.

חשוב לזכור להפגין סטנדרטיזציה בכל שלב. אנו עושים זאת כדי להבטיח יעילות סימון וחיוניות תאים עקביים, כך שניתן יהיה להשוות תוצאות מניסויים שונים. זהו כל התהליך.

תודה לצפייה ובהצלחה בסימון התאים שלכם.