Name: תיוג בתאי גזע עם צבעי ניאון על איתור פולשני עם דימות אופטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-02T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: למדו לתייג תאי גזע עובריים ומזנכימליים בצבעי ניאון לצורך מעקב פולשני אחרי השתלתם. שיטה זו מאפשרת ניטור תאים בחי וניתוח היסטופתולוגי במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה מומן על ידי מענק ג&#39;יי טל! SEED ליאון ממכון קליפורניה עבור רפואה רגנרטיבית. טוביאס הנינג המחקר מומן על ידי מענק מן האגודה הגרמנית למחקר (DFG, HE 4578/1-2). אנחנו רוצים להכיר תודה Meneses חואניטו את עצתו על תרבות בתאי גזע עובריים אנושיים.

תיוג של בתאי גזע mesenchymal עם צבע פלואורסצנטי האם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל את הליך תיוג בתאי גזע mesenchymal, trypsinize ולספור את התאים כדי לקבל השעיה עם מספר מוגדר של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את התאים מתוך החממה לשאוב את התקשורת הישנה של צלוחיות המכילות את התאים להיות מתויג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם 10 מ&quot;ל של Mg / Ca ללא PBS. לשאוב את PBS. מ&quot;ג ו Ca היה לעכב את טריפסין, ולכן אנו משתמשים PBS בלי אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טרום חימם טריפסין 0.05%, עבור בקבוק T75 נשתמש 5 מ&quot;ל. ודא כי כל שטח הבקבוק מכוסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממה כ -5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשר את ניתוק מתחת למיקרוסקופ. אם התאים עדיין דבקים הבקבוק, הקש את זה כמה פעמים ולחכות עוד קצת עד trypsinization הוא מוצלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כעת, יש צורך לנטרל את טריפסין על ידי הוספת מדיה FCS המכיל 10%. אנו משתמשים מידה שווה של התקשורת כפי שיש טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים על מנת להבטיח כי כל התאים מחדש מושעה בתקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את פתרון התא צינור פוליפרופילן 15 מ&quot;ל סטרילי כתרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב RCF 400 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את supernatant הבטחת לא להפריע תא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים DMEM וכדי להמשיך לספור את התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את התאים להיות מתויג בצפיפות של 1x10 ^ 6 מ&quot;ל לכל במדיום סרום ללא תרבות (DMEM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה היה כל הכנה של השעיה התא. עכשיו, הוא מוכן להתחיל את התוויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, להוסיף 5 μL של חומר ניגוד האם לכל מ&quot;ל של השעיה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לערבב בעדינות את הפתרון על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם פתרון תיוג על 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות בכלי התקשרות נמוך-6-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה הפשוטה היא מלאה, יש צורך להעביר את פתרון התא צינור פוליפרופילן כתרים 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה זה למטה RCF 400 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום תיוג, כדי להבטיח שלא להפריע תא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם PBS. פיפטה התאים מעלה ומטה, כדי לוודא לפרק את התא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שני השלבים האחרונים עוד פעמיים, כך שיש סך של 3 שלבים כביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים ולבצע בדיקה כחול Trypan לקבוע כדאיות התא. אלה מקובלים תרבית תאים פרוטוקולים שאנו לא הולך להסביר כאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים שלך מוכנים כעת להיות הדמיה imager אופטי. </li></ol> תיוג של בתאי גזע עובריים אנושיים עם ICG את צבע פלואורסצנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל את הליך תיוג בתאי גזע עובריים אנושיים, להכין את חומר ניגוד Indocyanine הירוק. מערבבים אותו עם protamine הסוכן transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את 1mg של אבקת Indocyanine הירוק. ממיסים את אבקת ICG ב 100 μL של Sulfoxide דימתיל (DMSO). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 400 μL של השתנה Dulbecco של הנשרים בינוני (DMEM + עגל עוברית 10% סרום) מדיה לתערובת ולנער אותו היטב. התוצאה היא ריכוז סופי של 2mg/ml של Indocyanine הירוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את protamine סוכן transfection. מעשים protamine כמו מעבורת עבור הסוכן לעומת זאת, כך שהוא מקבל לתוך התא בצורה יעילה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 5 סולפט protamine μL, אשר סיפקה בריכוז של 10mg/ml, עם ICG 300 ו - 300 μL השתנה μL בסרום חינם של Dulbecco בינוני הנשרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נער בעדינות את הפתרון transfection חדש למשך 5 דקות כדי לאפשר מורכבים הטופס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון תיוג מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את התקשורת הישנה של צלחת פטרי hESC 10mm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של טרום חימם סרום ללא DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את פתרון protamine / ICG מוכן בעבר את התאים. הפעל את הדגירה 1 שעה על ידי הנחת צלחת באינקובטור ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה תושלם, להסיר את צלחת מן החממה לשאוב את הפתרון תיוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים על ידי שטיפת צלחת עם 5 מ&quot;ל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את PBS ולהחליף עם 5 מ&quot;ל של טריפסין 0.25%. דגירה את המנה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לאפשר trypsinization להתרחש. זה עוזר לנער את המנה קצת מדי פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה בעדינות מעלה ומטה, כדי לשבור את המושבות שנותרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל את טריפסין על ידי הוספת סכום השווה ל KSR של המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את פתרון התא שפופרת 15 מ&quot;ל ו צנטריפוגות הפתרון ב RCF 400 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים התקשורת מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם עדיין יש גושים בשלב זה, trypsinize ו צנטריפוגות שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעם גוש ללא פתרון תא מושגת, לשאוב את המדיה הישנה resuspend את הכדור ב 10 מ&quot;ל של טרום חימם בתקשורת מלא ESC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, יש צורך להפריד את העכבר מזין תאים hESCs. הדבר נעשה על מנת להבטיח כי, מאוחר יותר, רק בתאי גזע הדמיה מתרחשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשם כך, העברת הדואר פתרון התא צלחת מצופה ג&#39;לטין 10 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את המנה לתוך 37 ° C חממה ולתת לו לשבת במשך 45 דקות. במהלך תקופה זו, ודא שלא להפריע את המנה. עכשיו, ניזונים תדבק המנה ואת בתאי גזע לא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון מתוך צלחת פטרי. ועכשיו יש לנו פתרון אחד של תאים שכותרתו בתאי גזע עובריים אנושיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים כעת ניתן לספור ובדיקת כחול Trypan ניתן לבצע אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים מוכנים להיות צילמו! </li></ol>

<ol><li>Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Metz, S., Piontek, G., Settles, M., Pichler, B., Heinzmann, U., Weinmann, H. J., Schlegel, J., Link, T. M., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+tracking+with+Gadophrin-2+--+a+bifunctional+contrast+agent+for+MR+imaging%2C+optical+imaging+and+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Stem cell tracking with Gadophrin-2 -- a bifunctional contrast agent for MR imaging, optical imaging and fluorescence microscopy.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 31, 1312-1321 (2004).</li>
<li>Simon, G. H., Daldrup-Link, H. E., Kau, J., Metz, S., Schlegel, J., Piontek, G., Saborowski, O., Demos, S., Duyster, J., Pichler, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+experimental+arthritis+using+allogeneic+leukocytes+labeled+with+a+near-infrared+fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+%26+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of experimental arthritis using allogeneic leukocytes labeled with a near-infrared fluorescent probe.</a> Eur J Nucl Med & Mol Imaging. 33, 998-1006 (2006).</li>
<li>Sutton, E., Henning, T., Pichler, B., Bremer, C., Daldrup-Link, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Tracking+with+Optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Radiol%22%5BJournal%5D)">Cell Tracking with Optical imaging.</a> Eur Radiol. 2, 350-357 (2003).</li>
<li>Funovics, M. A., Alencar, H., Su, H. S., Khazaie, K., Weissleder, R., Mahmood, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+multichannel+near+infrared+endoscope+for+mouse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Miniaturized multichannel near infrared endoscope for mouse imaging.</a> Mol Imaging. 2, 350-357 (2003).</li>
</ol>

הו, היא טכניקת דימות חדשה יחסית, מבוססת על זיהוי של הקרינה. הו, הוא רגיש כמו radiotracer מבוססי טכניקות הדמיה, אך לא קשורה לחשיפה בכל הקרנה. הו, מספק אמצעי יעיל של תאים מעקב פולשני ו שוב ושוב, ובכך לספק תובנה נדידת תאים לאתר היעד. מגבלה אחת גדולה של הטכניקה היא חדירה לרקמות מוגבל של בדיקות ניאון in vivo. לכן, הצטברות נותב ברקמות עמוקות יותר על 50-10 ס&quot;מ מעל פני העור, לא ניתן לזהות. יישומים קליניים נוכחי מוגבלים טכניקות שטחיות כגון הדמיה אנדוסקופית, לב וכלי דם רשתיות (Funovics et al. 2003) אבל זה ...

<table><tbody><tr><td>אינדוציאנין גרין (IR-125)</td><td>ריאגנט</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC41254-1000</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM עם ריכוז גבוה של גלוקוז </td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>דלל לריכוז סופי של 0.1% ב-PBS</td></tr><tr><td>PBS, ללא Mg ו-Ca</td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.05% </td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.25% </td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>25200-114</td><td></td></tr><tr><td>FCS, מאופיין</td><td>ריאגנט</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>מסנן תאים (40 &amp;mu;ניילון (Nylon)</td><td>ריאגנט</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>הבדלים בהבדלים (DiD)</td><td>ריאגנט</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>V-22887</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Knockout</td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>תחליף סרום Knockout</td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>בטא-מרקפטואטול (β-Mercaptoethanol)&amp;#8211;אתנול </td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7522</td><td></td></tr><tr><td>חומצות אמינו שאינן חיוניות </td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>ריאגנט</td><td>R&amp;D&S Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>גלוטמין 200mM </td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטריפטומייצין</td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>פרוטמין סולפט</td><td>ריאגנט</td><td>American Pharmaceutical Partners</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

תיוג בתאי גזע עם צבעי ניאון על איתור פולשני עם דימות אופטי

 Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

דימות אופטי (OI) היא כלי קל, מהיר וזול עבור ניטור vivo של טיפולים בתאי גזע חדש מבוסס. הטכניקה מבוססת על תיוג vivo לשעבר בתאי גזע עם פלורסנט לצבוע, הזרקה תוך ורידית הבאים של התאים שכותרתו ויזואליזציה של הצטברות שלהם אברי המטרה או פתולוגיות ספציפיות. הטכניקה הציג מדגים כיצד אנו תווית אדם בתאי גזע mesenchymal (hMSC) הדגירה על ידי פשוט עם צבע פלואורסצנטי lipophilic האם (C67H103CIN2O3S) ואיך אנחנו תווית אנושי לתאי גזע עובריים (hESC) עם ה-FDA אישר צבע פלואורסצנטי Indocyanine גרין (ICG). מנגנון ספיגת היא דרך הדבקות ואת דיפוזיה של צבען lypophilic ברחבי bilayer קרום התא פוספוליפידים. יעילות תיוג משופר בדרך כלל אם התאים מודגרת עם הצבע בסרום ללא מדיה להבדיל הדגירה בנסיוב המכיל התקשורת. יתר על כן, תוספת של סולפט סוכן transfection protamine משפר משמעותית את ספיגת חומר ניגוד.

וידאו זה מציג טכניקות תיוג של אדם בתאי גזע עובריים ותאי גזע mesenchymal עם צבעי ניאון. טכניקה זו יכולה לשמש in vivo מעקב בתאי גזע המושתלים עם הדמיה אופטית עבור מתאמים histopathological עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

דימות אופטי (OI) הוא כלי פשוט, מהיר וזול לניטור in vivo של טיפולים חדשים מבוססי תאי גזע. הטכניקה מבוססת על ex vivo...

ברוכים הבאים למעבדה של ד"ר Hiku Alge Blink. אנו מבקשים להודות למכון קליפורניה לרפואה רגנרטיבית על מימון פרויקט זה. סימון תאי גזע באמצעות חומר ניגוד פלואורסצנטי מאפשר מעקב in vivo אחר תאי גזע מושתלים in vivo.דימוג אופטי עוקב של התאים הגזעיים המסומנים מאפשר מחקרים אורכיים שבהם ניתן לנטר באופן לא פולשני את נדידת התאים in vivo. סרטון זה יראה לכם כיצד לסמן הן תאי גזע עובריים אנושיים והן תאי גזע מזנכימליים אנושיים באמצעות צבעים פלואורסצנטיים. שלום, אני סופי בודינגטון מקבוצת המחקר של חומרי ניגוד במחלקה לרדיולוגיה באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו.היום אני מעוניין להראות לכם שתי טכניקות שונות לסימון תאי גזע באמצעות חומרי ניגוד פלואורסצנטיים. אחת לסימון תאי גזע מזנכימליים עם הצבע הפלואורסצנטי, DID, ואחרת לסימון תאי גזע עובריים אנושיים עם endign ingra. אז הרשו לי להתחיל ולהראות לכם את הטכניקה שלנו לסימון תאי גזע מזנכימליים אנושיים באמצעות DID.כדי להתחיל בהליך הסימון של תאי גזע מזנכימליים, עלינו לנתח ולספור אותם כדי להגיע לסספנסיה עם מספר תאים מוגדר. מכיוון שמדובר בטכניקה סטנדרטית של תרבית רקמות, לא נציגה אותה בפירוט. אנו מעוניינים להסבי את התאים שנסמן בצפיפות של 1 מיליון תאים למיליליטר במצע תרבית נטול סרום.ראשית, נוסיף 5 µL של חומר ניגוד DID לכל 1 mL של תרחיף תאים. כעת נערבב את התמיסה באמצעות פיפטאג עדין. התאים מדוגרים עם תמיסת הסימון בצלחת בעלת 6 בארות עם הידבקות נמוכה (low attachment) בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות. עם סיום הדגירה הפשוטה, נעביר כעת את תמיסת התאים למבחנה לצנטריפוגה בנפח 15 mL.אנו סובבים את הדגימה בצנטריפוגה ב-400 RCF למשך חמש דקות. לאחר מכן, אנו שואבים החוצה את מדיום הסימון תוך כדי הקפדה שלא להפריע למשקע. כעת אנו שוטפים את התאים עם PBS.אנו שואבים ופורקים את התאים עם פיפטה, תוךما וודאות שמשקיע התאים התפרק. אנו חוזרים על שני השלבים האחרונים פעמיים נוספות, כך שיהיו לנו סך הכל שלושה שלבי שטיפה.כעת נספור את התאים ונבצע בדיקת trypan blue כדי לקבוע את חיוניות התאים. לאחר קביעת חיוניות התאים, התאים מוכנים כעת להדמיה במכשיר ההדמיה האופטי. כדי להתחיל את תהליך הסימון של תאי גזע עובריים אנושיים, עלינו להכין תחילה את חומר הניגוד המכונה Indocyanine Green.לאחר מכן, אנו מערבבים זאת עם חומר הטרנספקציה המכונה פרוטמין. ראשית, אנו מודדים 1 mg של אבקת indocyanine green וממסים אותה ב-100 µL של DMSO. אנו מוסיפים לתערובת 400 µL של DMEM המכיל 10% FCS ומערבבים היטב, מה שמותיר לנו ריכוז של 2 mg/mL של indocyanine green.בשלב הבא, אנו מוסיפים את חומר הטרנספקציה פרוטמין, המשמש כהסעה עבור חומר הניגוד ומאפשר לו להיכנס לתא ביעילות רבה יותר. כעת נערבב 5 µL של protamine sulfate בריכוז של 10 mg/mL עם 300 µL של ICG ו-300 µL של DMEM ללא סרום. כעת ננער את תמיסת הטרנספקציה החדשה במשך חמש דקות כדי לאפשר היווצרות של קומפלקסים.בשלב הבא, נשאב את המצע הישן ונוסיף לתאים 10 milliliters של DMEM שחומם מראש. נוסיף לתאים את תמיסת ה-protamine ICG שהוכנה קודם לכן, ונחיל דגירה של שעה אחת על ידי הנחת הצלחית באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C. עם סיום הדגירה, נוציא את הצלחית מהאינקובטור, נשאב את תמיססת הסימון ונשטוף את התאים על ידי שטיפת הצלחית עם חמישה milliliters של PBS.לאחר מכן, התאים עוברים עיבוד בטריפסין למשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 °C. ניעור של הכלי יסייע בהרחפת התאים. כעת נבצע פיפטור עדין למעלה ולמטה כדי לפרק את המושבות שנותרו.אנו מנטרלים את ה-trypsin על ידי הוספת כמות שווה של DMEM המכיל 10%FCS לצלוחית. לאחר מכן, אנו מעבירים את תמיסת התאים לפיתלה של 15 מיליליטר וסובבים את התמינה בצנטריפוגה ב-400 RCF למשך חמש דקות. אנו מרחפים מחדש את התאים במצע גידול מלא.כעת ניתן להסיר גושים או קומפלקסים ששאירו על ידי העברת התאים דרך מסנן תאים של 40 µm. ברגע שיש לנו תמיסת תאים ללא גושים, נשאב החוצה את המצע הישן ונשחיה מחדש את המשקע במצע תאי גזע עובריים אנושיים מלא שחומם מראש. בשלב זה, עלינו להפריד את תאי המזין של העכבר מתאי הגזע העובריים האנושיים.פעולה זו מבוצעת כדי להבטיח שבהמשך נדמה רק את תאי הגזע. לשם כך, אנו מעבירים את תמיסת התאים לצלחית פטרי בקוטר 10 סנטימטרים מצופה ג'לטין. אנו מכניסים את הצלחית לאנקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות ומניחים לה לעמוד במשך 45 דקות.במהלך זמן זה, יש להקפיד לא להפריע לצלחת. כעת תאי המזינים (feeders) יידבקו לצלחת, בעוד שתאי הגזע לא יידבקו. אנו מעבירים את התמיסה אל מחוץ לצלחת הפטרי, וכעת יש בידינו תמיסה מסומנת של תאי גזע עובריים אנושיים בודדים.כעת ניתן לספור את התאים ולבצע עליהם בדיקת trypan blue. לאחר אישור החיוניות, התאים שלנו מוכנים להדמיה. השקופית מראה דוגמה לאופן שבו ניתן להדמות תאי גזע in vivo בעכברים לאחר שסומנו בחומר ניגוד פלואורסצנטי והוחדרו באמצעות הזרקה IP.סריקות דימוי אופטי סדרתיות הראו הצטברות ראשונית של התאים בריאות, ולאחריה פיזור מחדש בכבד, במח העצמות של הגפיים ובבלוטת התריס. ניתן להשתמש בסימון הפלואורסצנטי גם להצגה ישירה של תאי גזע מושתלים בדגימות היסטופתולוגיות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. הרגע הצגנו לכם כיצד לסמן תאי גזם באמצעות חומרי ניגודיות פלואורסצנטיים בעת ביצוע סימון תאים.חשוב לזכור להפגין סטנדרטיזציה בכל שלב. אנו עושים זאת כדי להבטיח יעילות סימון וחיוניות תאים עקביים, כך שניתן יהיה להשוות תוצאות מניסויים שונים. זהו כל התהליך.תודה לצפייה ובהצלחה בסימון התאים שלכם.

labeling-stem-cells-with-fluorescent-dyes-for-non-invasive-detection

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

להערכת טיפולים בתאי גזע חדש חשוב הלא פולשני המסלול התאים מוזרקים in vivo. סרט הווידאו הזה יראה לכם כיצד לתייג אדם בתאי גזע mesenchymal ו עובריים עם סוכני תחמוצת ברזל מבוסס בניגוד in vivo עבור הבאים MR הדמיה in vivo.

תיוג hESCs ו hMSCs עם ברזל אוקסיד חלקיקים עבור פולשני של מעקב vivo עם MR Imaging

אנו מתארים טכניקה תיוג ומעקב בתאי גזע עם ה-FDA, תחמוצת ברזל פאראמגנטי (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). זו טכניקת דימות הסלולר אשר מנצל מגנטית (MR) תהודה להדמיה, הוא נגיש לניטור ארוך טווח האבחנה של להצליח או להיכשל engraftments תא גזע לחולים.

תיוג בתאי גזע עם Ferumoxytol, ה-FDA אוקסיד Nanoparticle ברזל

5 חלבוני ניאון קומבינטורית סימון של תאי גזע ואבות היווצרות הדם מאפשר במעקב משובט vivo באמצעות confocal ושני פוטונים במיקרוסקופ, מתן תובנות ארכיטקטורת hematopoietic מח העצם במהלך רגנרציה. שיטה זו מאפשרת מיפוי גורל לא פולשנית של תאים נגזרים HSPCs ספקטרלי מקודדים ברקמות שלמות לתקופות נרחבות של זמן לאחר השתלה.

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

במאמר זה אנו מתארים את העקרונות לתכנון וביצוע ניסוי מעקב שושלת רב-צבעוני באמצעות עכברי R26R-Confetti. אנו מספקים פרוטוקול ספציפי למעקב אחר תאי אפיתל בקרנית שניתן לשנות עבור רקמות אחרות מעניינות.

שיטה לאיתור שושלת של תאי קרנית באמצעות עכברים כתב ניאון רב-צבע

בשילוב של השתלת תאים, תיוג שלד ציטו וגישות אובדן/רווח תפקוד, פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להשתמש בצלחת הקדם-כורדלית הפוטנציאלית של דג הזברה הנודד כדי לנתח את תפקודו של גן מועמד בנדידת תאים in vivo.

ניתוח<em&gt; In vivo</em&gt; נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה

פרוטוקול זה מתאר דרך יעילה כדי לנטר את התא התמדה ואת biodistribution של האדם נגזר שומן בתאי גזע mesenchymal (haMSCs) על-ידי קרינה פלואורסצנטית מרחיקת אדום תיוג במודל חולדה דלקת מפרקים ניוונית (קואה) הברך באמצעות הזרקה תוך-מפרקיות (IA).

אין ויוו מעקב של האדם נגזר שומן בתאי גזע Mesenchymal במודל דלקת מפרקים ניוונית של הברך עכברוש עם קרום Lipophilic פלורסנט לצבוע

שימוש בתאי אפיתל הערמונית העיקרי האנושי, אנו מדווחים על שיטה ביוארינקר הרומן החופשי של אפיון פונקציונלי של תאים גזע דמוי על ידי שמירת תווית מבוסס ספרואיד מבוססי. פרוטוקול צעד אחר צעד מתואר עבור BrdU, CFSE, או הרחוק האדום תיוג תא 2D; היווצרות ספרואיד תלת מימדי; זיהוי תאים מתמך בתוויות באמצעות כימיה חיסונית מדומה; ובידוד על ידי FACS.

בידוד של תאים כמו גזע מתרבויות תלת ממדיות ספרואיד

פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיות לזיהוי והעשרה של מצב התא בתרביות תאי גזע עצביים ראשוניים של עכברים בוגרים על ידי הדמיה אוטופלואורסצנטית באמצעות i) מיקרוסקופ קונפוקלי, ii) ממיין תאים מופעל פלואורסצנטי לביצוע דימות עוצמה, או iii) מיקרוסקופ מולטיפוטון לביצוע הדמיה פלואורסצנטית לכל החיים.

סיווג מצב הפעלת תאי גזע עצביים במבחנה באמצעות אוטופלואורסנציה

שיטת ההדמיה התוך-ורידית המתוארת כאן משתמשת בדור ההרמוני השני של הקולגן ובפלואורסצנציה אנדוגנית מהקו-פקטור המטבולי NAD(P)H כדי לפלח באופן לא פולשני מיקרו-סביבה של גידול ללא תווית לתוך תאי גידול, סטרומל וכלי דם לצורך ניתוח מעמיק של תמונות תוך-ורידיות 4D.

גישת סגמנטציה ללא תווית להדמיה תוך-ורידית של מיקרו-סביבה של גידולי יונקים

החותכת לעכבר מכילה תאים שומרי תוויות יקרי ערך בנישת תאי הגזע שלה. יש לנו דרך חדשה לזהות ולכמת באופן בלתי משוחד את התאים שומרי התווית; המחקר שלנו השתמש בתיוג EdU ובגישת שחזור תלת ממדית לאחר ניקוי רקמות פגסוס של הלסת התחתונה.

זיהוי וכימות של תאים שומרי תוויות בחותכות עכבר באמצעות גישת שחזור תלת-ממדית לאחר ניקוי רקמות

היכולת לסמן באופן קבוע תאי גזע וצאצאיהם באמצעות פלואורופור באמצעות קו עכברים מהונדס בלתי ניתן להשראה מאפשרת ניתוח מרחבי וזמני של הפעלה, התפשטות, נדידה ו/או התמיינות in vivo. מעקב אחר שושלת יכול לחשוף מידע חדש על מחויבות לשושלת, תגובה להתערבויות ורב-תחומיות.

מעקב אחר שושלת של תאי גזע בעלי תווית פלואורסצנטית אינדוקטיבית במוח העכבר הבוגר

למדו לתייג תאי גזע עובריים ומזנכימליים בצבעי ניאון לצורך מעקב פולשני אחרי השתלתם. שיטה זו מאפשרת ניטור תאים בחי וניתוח היסטופתולוגי במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תיוג בתאי גזע עם צבעי ניאון על איתור פולשני עם דימות אופטי

גלה סרטונים נוספים