פרופיל מרחבי מקיף של טרנסקריפטומים אגנוסטיים למינים באמצעות סטריאו-רצף

המחקר שלנו מתמקד באפיון מפורט של מיקרו-סביבת הגידול בשחלות כדי לזהות סמנים ביולוגיים חזויים וטיפוליים. לדוגמה, היינו רוצים למצוא סמנים לחיזוי תגובת כימותרפיה ועמידות לכימותרפיה או מטרות טיפוליות חדשות לטיפולים בקו שני. האתגרים הניסיוניים כוללים את הטיפול בדגימה, הערכת איכות הדגימה, ומשך זמן עיבוד הדגימה.

בצד של ניתוח הנתונים, האתגרים כוללים דברים כמו דלילות הנתונים, בדומה לתהליכים חד-תאיים אחרים, וגם מיפוי אזורים, במיוחד אזורים חוזרים. לאחר הסרת שבב N-Chip עם רצף סטריאו מהאריזה, יש להקליט את מספר זיהוי השבב. בלי לגעת במשטח ה-N-Chip, נקה את מחסנית הזכוכית עם 100% אתנול.

באמצעות מיקרופיפטה, מרחו בזהירות 10 מיקרוליטרים של שרף קרמי אולטרה-סגול הניתן לריפוי סביב קצה שבב N עם רצף סטריאו. השתמש במקלון קצף אטום כדי להסיר עודפי שרף, ולהשאיר רק קו דק סביב קצה השבב. הכניסו את המחסנית למכשיר הקיבוש האולטרה-סגול, כדי לוודא שמשטח השבב לא ייגע.

כעת הנח את השבב המוחל בשרף על מעל מסכה אטומה על מקור האור האולטרה-סגול בקוטר 405 ננומטר כדי להאיר את גב המחסנית, ולהתייבש למשך חמש דקות. לאחר הקיבוש, השתמשו במקליות קצף אטומות שהושרו ב-100% אתנול בדרגה מולקולרית, אחר כך ב-70% אתנול, ולבסוף במים נטולי נוקלאז כדי לנקות סביב הקצה המיושם בשרף. טבלו את השבב שלוש פעמים במים טריים ללא נוקלאז באמצעות צינור קונוסי בנפח 50 מיליליטר.

באמצעות אוויר דחוס, ייבשו את השבב במלוא כוח האוויר בזווית של כ-60 עד 80 מעלות, תוך תנועה אלכסונית על פני השטח ממרחק של כחמישה סנטימטרים. לאחר מכן, מרחו 150 מיקרוליטר של תמיסת Poly-L-Lysine באופן אחיד על פני כל משטח השבב, ודגרו את השבב במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הסר את תמיסת פולי-אל-ליזין מהשבב.

לאחר הכביסה השנייה, ייבשו בזהירות את קצוות המחסנית מבלי לגעת במשטח השברים. ייבשו היטב את השבב באמצעות אוויר דחוס כפי שהודגמו קודם. בעת חתך רקמת ה-FFPE, אל תיגע בשבב ישירות, ותכסו רק 80% מהשבב ברקמה.

להכנת שני מיקרוליטרים של תמיסת צביעת DNA חד-גדילית במאגר SSC, מדלל את מגיב ה-DNA החד-גדילי של קיוביט עם 5X בופר SSC. צרו תערובת ראשית של תמיסת צביעה באמצעות דילול של מעכב ריבונוקלאז, דילול אחד עד 200 של תמיסת ה-DNA החד-גדילית, והנפח הנותר עם בופר SSC פי 5. הוסיפו 150 מיקרוליטר של תמיסת צביעה לכל שבב ודגרו בחושך בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

לאחר מכן הסירו בעדינות את תמיסת הכתם מפינת כל שבב באמצעות פיפטה. לאחר שטיפת השבב פעמיים עם בופר SSC של 0.1X למשך 10 עד 15 שניות, ייבשו בזהירות את קצוות הסלייד. הוסיפו כשלושה עד חמישה מיקרוליטרים של גליצרול למחסנית כדי להתקין אותה.

הורד כיסוי ממרחק של כ-סנטימטר אחד מעל הסלייד, לשמור על איזון ולוודא שהוא לא נוגע במשטח השבב. ללכוד תמונות פלואורסצנטיות של רקמה צבועה ב-DNA חד-גדילי באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב, תוך הבטחת חפיפה של 10% בין אריחי התמונה. תפר את התמונות שנרכשו בתוכנות עיבוד תמונה כמו ImageJ על ידי שימוש תחילה בחפיפה תיאורטית ליצירת מיקומי אריחים משוערים, ואז יישום חפיפה חישובית התאמת פיקסלים כדי לכוונן את הריצופים.

עבד את התמונות התפורות בתוכנת StereoMap, וודא שבקרת איכות התמונה עברה לפני שממשיכים. טבלו את סלייד הרצף הסטריאו ב-30 מיליליטר של בופר SSC 0.1X עד שהכיסוי מתנתק. ודא שמגיב ההסרה של FFPE נמצא בטמפרטורת החדר ובדוק אותו לאיתור חלקיקים.

הפעל את התרמחזור והגדר אותו ל-30 מעלות צלזיוס לשיווי משקל, 95 מעלות צלזיוס לאינקובציה של 30 דקות, והחזקה אינסופית בארבע מעלות צלזיוס. הרכיבו את אטם הקסטה והניחו את סלייד השבב של רצף הסטריאו בתוך הקסטה. לאחר מכן הוסיפו תגובת דה-קרוסלינקינג FFPE לתוך באר קסטת הסלייד סטריאו-סקוונסינג, מרחו סרט אטימה על הקסטה וודא שהיא אטומה היטב.

התחילו את הדגירה של 30 דקות בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס. לאחר 10 דקות, הניחו 25 מיליליטר מתנול במיכל של 50 מיליליטר במקפיא בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס, ומכינים כ-מיליליטר אחד לכל שקופית לשימוש מאוחר יותר. לאחר הסרת השבב מהתרמחזור, העבר את קלטת הסלייד לשולחן והסיר את סרט האיטום.

באמצעות פיפטה, הסר והשליך את תגובת ההסרה של FFPE מהקלטת. לאחר שהמגיב הוסר לחלוטין, נתק את הקסטה והאטם והשליך אותם. מתחת למכסה אדים סטרילי, ייבשו את קצה המחסנית, ומרחים תא סיליקון חדש במידת הצורך.

הוסיפו 500 מיקרוליטר של מתנול מקורר ממקפיא בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס, כדי להבטיח שכל החלק יהיה שקוע במים. תמיסת PR מחממת מראש על בלוק יבש של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפני השימוש. אחרי הקיבעון, בתוך מכסה אדים, מנקים כל מתנול עודף מהמחסנית והמתינו שהמתנול שנותר על השבב יתאדה.

הרכיבו אטם קצה קסטה חדש. לאחר סיום האידוי, הניחו את סלייד השבב לרצף הסטריאו בתוך הקסטה. הוסיפו 200 מיקרוליטר של מגיב חדירות מחומם מראש לשבב.

הדביקו סרט אטימה על קסטת הסריקופנס הסטריאו וודאו שהיא אטומה היטב. בצע שעתוק הפוך ולאחר מכן שחרור וטיהור CDNA בהתאם לשלבים המוצג כאן. חימום מוקדם של מים ללא נוקלאז ל-37 מעלות צלזיוס.

הסר את האטימה מהשבב. פיפט בעוצמה בכל פינה ובמרכז השבב מעל הרקמה מבלי לגרד או לגעת בה. אסוף את כל תערובת שחרור ה-DNA המשלמת מהשבב והעבר אותה לצינור צנטריפוגה בנפח 1.5 או 2.0 מיליליטר.

הוסיפו 350 מיקרוליטר של מים מחוממים מראש ללא נוקלאז ישירות על פני השבב. פיפט בעוצמה עם פיפטה קטנה יותר, כשהקצה מנסה להפעיל כוח חזק מבלי לגעת ברקמה או לשרוט את השבר. שלבו את השטיפה עם 400 מיקרוליטר של תערובת שחרור DNA משלימה שנאספה קודם, כדי להבטיח שרק חומר משבב אחד משולב.

שים 100 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז על השבב. אטום את מחסנית הרצף הסטריאו, ושמור אותו במקרר עד סוף הפרוטוקול. סגמנטציה של תא יחיד באמצעות צינור SAW הושגה בחתכי FFPE, מה שאפשר מיפוי ל-RNA שאינם פוליאדנילטים כמו tRNA, TRDMT1.

הדמיה מרחבית אינטראקטיבית הראתה סוגי תאים משוערים באמצעות התוכנה הקניינית StereoMap, כאשר אשכולות הוצגו בצבעים שונים באזור מוגדל של הרקמה. ביטוי רקמתי שלם של ה-RNA TRDMT1 הלא-פוליאדינילטי הוצג באמצעות StereoPi. ההתאמות של הפרוטוקול מטפלות בבעיות שהיו לנו בפרופיל מרחבי מלא של רקמות שומן ושבריריות בטרנסקריפטומיקה על ידי שיפור ההידבקות ברקמות, נגישות ה-RNA וטיפול ב-Stereo-Seqs על סוגי רקמות מורכבים אלה.

כיום Stereo-seq מספק רזולוציה גבוהה יותר משיטות טרנסקריפטומיות מרחביות אחרות עם רזולוציה של 500 ננומטרים לעומת שני מיקרונים. הוא גם מספק לכידה בלתי מוטה הנדרשת לחקר המיקרוביום, הוויראלים והלא פוליאדניליים.