שיטה זעיר פולשנית ליצירת מודל עכבר אורתוטופי סינגני של סרטן ריאות

המחקר הנוכחי שלנו מתמקד בהבנת מחלות סרטן הריאות וכיצד לפתח שיטות טיפול חדשות התואמות טיפול סטנדרטי, כולל כימותרפיה, קרינה ואימונותרפיה. לא הצלחנו למצוא מודל סרטן ריאות אורטופי שקבע קריטריונים למחקר ספציפי של סרטן ריאות בשלב מוקדם. אנו פועלים לספק קווים מנחים ברורים וניתנים לשכפול כדי לטפל בפער זה בפרוטוקול זה.

פרוטוקול זה הוא מינימלי פולשני ופשוט לביצוע. בנוסף, בהתאם לקריטריונים שסיפקנו, פרוטוקול זה מאפשר סקר של השתלת גידול מדויקת ומאפשר גילוי מוקדם של גידולים באמצעות הדמיה ביולומינצנטית. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לחקור סרטן ריאות בשלב מוקדם ברקמת המארח, ומאפשר התקדמות פרה-קלינית של טיפולים חדשניים לסרטן וחקירה של מיקרו-סביבת הגידול.

נשתמש בטכניקה זו כדי להעריך את המנגנונים והיעילות של טיפולים חדשים ומרגשים לסרטן ריאות קדם-קלינית, ונקווה שהיא תוביל לטיפול עתידי בחולים. כדי להתחיל, מניחים את העכבר המורדם בקונוס אף במצב שכיבה על מכשיר חימום, ומרחו משחת עיניים על שתי עיני העכבר. לאחר אישור ההרדמה, יש להשתמש במספור חשמלי כדי להסיר פרווה מאזור מלבני בגודל שניים על שלושה סנטימטרים בצד הגבי השמאלי של העכבר.

מגלח מהעמוד השדרה בצד המדיאלי, מהשולחן לצדדים, את הצלע האחרונה תחתונה ואת הקצה העליון של השכמה לכיוון הראש עד שלא נראית פרווה. הנח את העכבר בכלוב ריק על מכשיר חימום. התבוננו בדפוס הנשימה עד שהעכבר יחזור לערנות ואז החזירו לכלוב הביתי שלו עד לניתוח.

ביום איסוף התאים, הוסף חומר טרי המכיל 50 מיליגרם למיליליטר גנטמיצין ללוח התרבית שלוש עד ארבע שעות לפני האיסוף. שאפו את המדיה מלוח התרבית ושטפו את התאים המחוברים עם 1x PBS. לאחר מכן דגרו את התאים בתמיסת טריפסין EDTA למשך דקה עד שתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

הוסף חומר טרי כדי לנטרל את הטריפסין. פזר את התאים על ידי טפיחה עדינה או פיפטינג של הצלחת. לאחר מכן אסוף את מתלי התא לתוך צינור קוני בנפח 50 מיליליטר.

עכשיו, צנטריפוגה את הצינור הקוני בעוצמה של 1,200 גרם למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר אישור קיומו של כדור קומפקטי בתחתית, שאיפו את הכדור העליון ושטפו את הכדור עם PBS. החזירו את כדור התאים השטופים ב-PBS כדי להגיע לריכוז של כ-1 עד 2 מיליון תאים למיליליטר לספירה.

סנן את המתלה דרך מסננת תא 40 מיקרומטר לפני שמתחילים. לאחר מכן, שלבו 10 מיקרוליטר של מתלים תאיים עם 10 מיקרוליטר של טרייפן בלו. טען את הדגימה המוצבעת למכשיר המוסציטומטר וספר את התאים.

חשב את מספר התאים הכולל ואת יכולת העמידות של התאים. צנטריפוגה שוב את התאים בטמפרטורה של 1,200 גרם למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר ושאופי את ה-PBS משאיר את הכדור. החזירו את כדור התא ב-0.5 מיליגרם למיליליטר של ג'ל מטרה ב-PBS.

כוון למספר התאים הרצוי בנפח הזרקה כולל של 50 מיקרוליטר. השאירו את תליית התא על קרח כדי למנוע התגבשות חומרה. נקה את אתר הניתוח של החיה המורדמת שלוש פעמים באמצעות גזה סטרילית, לסירוגין בין בטדין ל-70% אתנול.

מניח וילון כירורגי מחוקר עם פתח של שלושה על ארבעה סנטימטרים מעל העכבר ומניח כלי ניתוח אוטוקלאב מעל הווילון. באמצעות מלקחיים, זהה את קצה הגולגולת של השכמות ואת קצה הפינוק של כלוב הצלעות החזה. כאשר העור מתוח בין אגודל המנתח לאצבע המורה, בצעו חתך עור שטחי בקוטר חמישה מילימטרים ישירות מתחת לשכמה באמצעות להב סכין מידה 10.

לאחר מכן השתמש במספריים ישרים בקוטר 115 מ"מ כדי לפרק את השומן התת-עורי מהצלעות ומהשרירים הבין-צלעיים בלי לחתוך אותם. כדי לעצור כל דימום קל הנגרם מנזק לנימים, לחץ בעדינות אפליקטור עם קצה כותנה מחוטא על אזור הדימום. החזק את החתך פתוח עם מיקרו-פרסומות ומלקחיים.

מתחילים בצלע האמיתית השביעית, השתמשו במלקחיים מעוקלים כדי לספור כלפי מעלה ולאתר את הצלעות הרביעית והחמישית. סמנו את האזור הזה כאתר ההזרקה. עכשיו, הפכו בעדינות את צינור התלייה של התא שלוש עד ארבע פעמים כדי לערבב.

רגע לפני ההזרקה, משוך 50 מיקרוליטר מהמתלה לתוך מזרק אינסולין סטרילי בנפח 300 מיקרוליטר 31 גייג' 8 מ"מ, וודא שאין בועות. הניחו רצועת סרט מתכת מעוטא בעובי ארבעה מילימטרים שמחוברת למזרק כדי לשמש כעוצר ולשלוט בעומק ההזרקה. הזריק את תליית התא בנפח 50 מיקרוליטר בזווית של 90 מעלות למרחב הבין-צלעי בין הצלעות ארבע וחמש ישירות מתחת לצלע הרביעית, והחזק את המחט במקומה למשך שתיים עד שלוש שניות.

לשלוף לאט את המחט באותה זווית שבה הוכנס וזרוק אותה במיכל חדות חדות. לבסוף, סגרו את חתך העור באמצעות שתיים עד שלוש תפרים מרובעים ומקושרים ומרחו דבק כירורגי וטרינרי על התפרים כדי לחזק את סגירת הפצע. הדמיית ביולומינסנציה זיהתה אותות קשורים לגידול בעכברים הניסיוניים כבר יום אחד לאחר ההזרקה והקרינה עלתה באופן ניכר לאורך זמן עבור 25,000 ו-50,000 תאים לכל קבוצת עכברים, עם עוצמה גבוהה יותר שנצפתה בקבוצת 50,000 התאים.

השטף הכולל של הגידול עלה באופן מעריכי בשתי קבוצות התאים של 25,000 ו-50,000, והגיע ליותר מ-10 פעמים 10 לעוצמה של שמונה פוטונים לשנייה ביום ה-21 בקבוצת 50,000 התאים. עכברי שמה לא הראו זוהר או גידול נראה לעין בריאות שנפרדו, בעוד שעכברים ניסיוניים הראו זוהר גבוה וגושים אדומים ברקמת הריאה. 21 ימים לאחר ההזרקה, העכברים שנכללו הראו גידולים מוגבלים לאונה הריאה השמאלית ללא חדירה לאזורים הסובבים.