Name: ניווט בנתונים פרוטאומיים מבוססי ספקטרומטריית מסה באמצעות כלים חישוביים חינמיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-19T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: למד לנתח נתונים פרוטאומיים מורכבים באמצעות כלים חישוביים חינמיים כמו DIA-NN ו-MSFragger. השיטה מאפשרת זיהוי שינויים בביטוי גנים בסרטן לבלב וכבד, ומסייעת לחוקרים לאמת ממצאים ממאגרי נתונים ציבוריים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הערה: ראה איור 1לסקירה כללית של זרימת העבודה וטבלת החומרים לתיאורים מפורטים של התוכנה שבה נעשה שימוש.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68707/68707fig1.jpg"> 
איור 1: סקירה כללית של תכנון המחקר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68707/68707fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
1. הגדרת קובץ ותוכנה לדוגמה
הערה: כל היישומים ניתנים בחינם לשימוש מחקרי פרטני וניתן להפעיל אותם במחשב אישי (Windows ו-Linux נתמכים).
<ol>
	<li>צור ספריה חדשה עבור פרוייקט.</li>
	<li>הורד JMU_LM2_8526_55.raw, JMU_LM2_8568_51.raw, JMU_LM2_8696_37.raw, JMU_LM2_2112_87.raw, JMU_LM2_2195_91.raw, JMU_LM2_2377_73.raw, 20150127_liver_XH03_T_01.raw, 20150127_liver_XH03_T_02.raw, 20150127_liver_XH03_T_03.raw, 20150127_liver_XH03_P_01.raw, 20150127_liver_XH03_P_02.raw, 20150127_liver_XH03_P_03.raw מ-PRIDE. הערה: ניתן להוריד את שתי קבוצות הקבצים מ-https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD039273 ו-https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD006512 בנפרד (איור 2).</li>
	<li>הורד והתקן את כלי התוכנה הנדרשים.<ol>
		<li>הורד את הגרסה העדכנית ביותר של DIA-NN כקובץ .msi. DIA-NN זמין באופן חופשי כקובץ .msi עבור Windows או קובץ .zip עבור לינוקס מ-https://github.com/vdemichev/DiaNN/releases/tag/2.0</li>
		<li>הורד את הגרסה העדכנית ביותר של MSFileReader כקובץ .exe. MSFileReader זמין באופן חופשי כקובץ .exe מ-https://github.com/thermofisherlsms/MSFileReader/blob/main/MSFileReader_x64.exe, הנדרש לעיבוד נתוני Thermo Fisher DIA בפורמט גולמי.</li>
		<li>הורד את הגירסה העדכנית ביותר של .NET SDK כקובץ .exe. .NET SDK זמין באופן חופשי כקובץ .exe מ-https://dotnet.microsoft.com/en-us/download, הנדרש ב-Windows כדי להפעיל את MSFileReader.</li>
		<li>הורד את הגרסה העדכנית ביותר של FragPipe כקובץ .zip. FragPipe זמין באופן חופשי כקובץ .zip מ-https://github.com/Nesvilab/FragPipe/releases. קובץ ה-zip עם jre מומלץ מכיוון שהוא מכיל זמן ריצה של Java עבור Windows, הדרוש להפעלת FragPipe. MSFragger מוטמע ב-FragPipe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>הורד את הגרסה העדכנית ביותר של קבצי סקריפט R ו-Rstudio ו-R מקובץ משלים 1 וקובץ משלים 2. ניתן להוריד את R ו-RStudio באופן חופשי מ-https://cran.rstudio.com/bin/windows/base/R-4.5.0-win.exe ו-https://posit.co/download/rstudio-desktop/.</li>
	<li>פתח את הקבצים הדחוסים ולחץ על . exe או .msi Files כדי להתקין את היישומים.</li>
</ol>
2. ניתוח נתוני DIA באמצעות DIA-NN
<ol>
	<li>הורד את קובץ ההפניה proteome fasta מ-UniProt. כדי להוריד את פרוטאום הייחוס של הומו ספיינס (מידע איזופורמי לא כלול) עבור אל https://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640 (איור 3A).</li>
	<li>לחץ על הוסף FASTA כפתור כדי לטעון את קובץ ההתייחסות ל- DIA-NN.</li>
	<li>בחר את שתי האפשרויות תקציר FASTA ליצירת חיפוש/ספרייה ללא ספרייה וספקטרום מבוסס למידה עמוקה, RTs ו-lMs תחת חלק יצירת יונים מבשר. לחץ על כפתור ההפעלה כדי ליצור ספרייה ספקטרלית חזויה (איור 3B).<ol>
		<li>לאחר יצירת קובץ הספרייה הספקטרלית החזוי, השתמש בו שוב עבור ניסויים אחרים באותן הגדרות רכישה ניסיוניות באמצעות לחיצה על כפתור ספקטרלי כדי להוסיף את הספרייה החזויה.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>בטל את הבחירה בשתי האפשרויות תחת החלק יצירת יונים מבשר ולחץ על כפתור הסוג שמתאים לפורמט הקובץ מתחת לחלק הקלט כדי לטעון את נתוני ה-DIA.</li>
	<li>הגדר את דיוק המסה ודיוק MS1 תחת אלגוריתם ל-0.0 עמודים לדקה.</li>
	<li>התאם את הגדרות טווח המסה של המבשר והשבר תחת חלק יצירת יונים מבשר בהתבסס על הגדרות הניסוי.</li>
	<li>שמור את הגדרות ברירת המחדל האחרות.<ol>
		<li>הדור המקדים של DIA-NN משתמש בטריפסין/P (נקרע אחרי K/R אלא אם כן אחריו פרולין) עם מחשוף אחד שהוחמץ כדי להדגים עיכול חלקי; השביתו את כריתת N-term M עבור פפטידים לא קנוניים (למשל, אימונופפטידומיקה) או הגדילו את המחשופים שהוחמצו ל-2 עבור פפטידים ארוכים יותר.</li>
		<li>הפעל במפורש שינויים משתנים (מושבתים כברירת מחדל) עבור מחקרי שינוי לאחר תרגום (PTM) (למשל, Ox (M) לחמצון, K-GG עבור ubiquitination), והרחיב מסנני פפטידים (אורך: 7-30 aa; טעינה: 1-4+; מבשר m/z: 300-1800) בהתאם להגדרות הניסוי (למשל, אורך: 5-50 aa, מטען = 1-6) עבור PTMs גדולים או עיכול לא טריפטי.</li>
		<li>הגדרות האלגוריתם ממנפות כיול אוטומטי (דיוק מסה = 0.0 עמודים לדקה) עבור יישור מסה מדויק - עקיפה עם טולרנסים ידניים (למשל, 10 עמודים לדקה) עבור מכשירים ברזולוציה נמוכה - והתאמה בין ריצות (MBR) מעבירה מזהים בין ריצות (השבתה עבור דגימות הטרוגניות).</li>
		<li>ניקוד רשת עצבית מגביר את ביטחון הזיהוי (שמירה אלא אם איכות הנתונים ירודה), בעוד שספקטרומטריית מסה קוונטית ללא תווית (UMS) מאפשרת כימות ללא תוויות ברמת דיוק גבוהה; עבור לכימות MS2 עבור תגים איזובריים (למשל, TMT). השתמש בחיפוש ללא ספרייה רק עם נתוני DIA ברזולוציה גבוהה כדי לעקוף את דרישות הספרייה הספקטרלית.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>לחץ על כפתור ההפעלה . המתן לתוצאות עד שסיים יוצג בממשק הפעולה המציין שהריצה הסתיימה (איור 3C).</li>
</ol>
3. ניתוח נתוני DDA באמצעות FragPipe
<ol>
	<li>לחץ על סמל Fragpipe בתיקייה ~\FragPipe\fragpipe\bin לאחר ההתקנה. ניתן לראות את כל ההגדרות התלויות בכרטיסייה תצורה. בדוק אם שלושת המודולים (MSFragger, IonQuant, diaTracer, DIA-NN ו-Python) קיימים במחשב שלך. אם לא, הורד אותם על ידי לחיצה על הורד/עדכן או הורד (איור 4A).</li>
	<li>מעבר לכרטיסיה הבאה, זרימת עבודה. בחר ברירת מחדל עבור זרימת העבודה ולחץ על טען זרימת עבודה. לחץ על הוסף קבצים כדי להוסיף נתיבי קבצים. הקצו שם ניסוי ומספר ביו-שכפול תחת הקצאת קבצים או פשוט השאירו אותו (איור 4B).</li>
	<li>כעת, לחץ על מסד נתונים ופנה לכרטיסייה זו. טען קובץ fasta או הורד כל קבצי fasta בהתאם למין הדגימות. בזמן ההורדה, בחר באפשרויות רצפים שנבדקו בלבד, הוסף פיתויים והוסף מזהמים נפוצים עבור ריצה פשוטה (איור 4C).</li>
	<li>לאחר מכן לחץ על MSFragger כדי לשנות את הכרטיסייה. בחר את תצורת ברירת המחדל של חיפוש סגור ולחץ על טען. הערה: החיפוש הסגור הוא בעצם חיפוש אחר השינויים שהגדרת בעוד שהחיפוש הפתוח יחקור את כל השינויים האפשריים מהנתונים, מה שגוזל יותר זמן וזיכרון.</li>
	<li>עבור התאמת שיא, שמור על הגדרות ברירת המחדל פרט לכך שמומלץ לבחור ללא עבור כיול ומיטוב, מכיוון שהיא תחסוך זמן.</li>
	<li>לעיכול חלבון, התאם את הפרמטרים בהתאם לתנאי הניסוי. שמור על הגדרות ברירת המחדל הבאות (איור 5A). הערה: סובלנות המסה של המבשר והשבר (± 20 ppm) מגדירה את שגיאת המסה המקסימלית המותרת להתאמת ספקטרום ניסיוני לפפטידים תיאורטיים, עם ערכים הדוקים יותר המומלצים עבור מכשירים ברזולוציה גבוהה. כללי האנזים (טריפסין קפדני) מציינים את ספציפיות המחשוף (אחרי K/R, אלא אם כן אחריו P), כאשר מחשופים שהוחמצו (2) מאפשרים פפטידים מעוכלים חלקית. מסנני אורך פפטיד (5-50 שאריות) ומסה (500-5000 Da) אינם כוללים מועמדים לא סבירים. שינויים משתנים (למשל, +15.9949 Da על מתיונין לחמצון, +79.96633 Da על S/T/Y לזרחון) מאפשרים זיהוי של שינויים כימיים, בעוד ששילובים מקסימליים (5) מגבילים שינויים בו-זמנית לכל פפטיד כדי לנהל את מרחב החיפוש. מקסימום מודים משתנים לכל אתר (למשל, 3 על M) שולט בתדירות השינוי. מסד נתונים מפוצל משפר את היעילות עבור פרוטאומים גדולים, ושגיאת איזוטופים (0/1/2) אחראית לשיאים איזוטופיים שהוקצו באופן שגוי. הגדרות אלה מאזנות ביחד רגישות, ספציפיות ועומס חישובי בזיהוי פפטידים.</li>
	<li>שנה לכרטיסיה אימות. בטל את הבחירה ב-Predict RT ו-Predict spectra, המיועד לנתוני DIA (איור 5B).</li>
	<li>לחץ על הכרטיסייה Quant (MS1). בחר הפעל MS1 quant ולחץ על טען ברירות מחדל כמות. בחר IonQuant ושמור על הגדרות ברירת המחדל (איור 6A). השבת את MBR עבור זמני שמירה לא יציבים או השבת את נורמליזציה של עוצמה אם נוצרות הטיות קנה מידה גלובלי; אפשר שמור אינדקס בדיסק כדי לחסוך ב-RAM עם ערכות נתונים גדולות. הערה: ברירת המחדל של Quant (MS1) היא לייעל את הכימות ללא תווית באמצעות MaxLPQ (כימות חלבון מבוסס MaxLFQ, אלגוריתם המרחיב את שיטת MaxLFQ לקבוצות חלבונים), הדורש ≥1 יון ייחודי לחלבון (הגדל ל-≥2 לחומרה גבוהה יותר במחיר הכיסוי). התאמה בין ריצות (MBR) מעבירה זיהויים בין ריצות באמצעות עמידות זמן שמירה (RT) (ברירת מחדל של 0.4 דקות; הידוק ל-0.2 דקות עבור כרומטוגרפיה יציבה או שחרור עבור שונות שיפוע) ועמידות ניידות יונים (IM) (ברירת מחדל 0.05 1/k0 [ניידות מופחתת הפוכה]; התאמה בהתבסס על דיוק של הודעות מיידיות), מסוננת לפי ≤1% FDR (שיעור גילוי שגוי; ברירת מחדל של יון MBR FDR=0.01; נמוכה ל-0.005 עבור קפדנות). הסקת חלבון משתמשת ב-uniquer+rascor (הקצאת פפטיד סכין גילוח לקיבוץ חלבונים). גילוי מאפיינים משתמש בסובלנות מסה של 10 ppm (הגדלה ל-20 ppm עבור MS ברזולוציה נמוכה או ירידה ל-5 ppm עבור רזולוציה גבוהה).</li>
	<li>כעת, לחץ על הכרטיסייה הפעלה . בחר ספריית פלט. לחץ על RUN כדי להתחיל לנתח את הנתונים (איור 6B). הערה: עבור נתוני פרוטאומיקה ללא תוויות שאינם מתמקדים בשינויים או משתמשים בכימות מבוסס תווית, לא נעשה שימוש בכרטיסיות PTMs, Glyco ו-Quant (איזוברי).</li>
</ol>
4. ניתוח DIA-NN/FragPipe במורד הזרם
הערה: קודים מפורטים המשמשים במחקר זה נכללים כקובץ משלים 1 וקובץ משלים 2. ניתן למצוא את גרסאות החבילה המשומשות במחקר זה בקובץ משלים 3.
<ol>
	<li>פתח את RStudio וקרא את נתוני ביטוי החלבון שנוצרו על ידי DIA-NN או FragPipe. נתוני מטריצת קבוצת חלבונים המסתיימים ב-.pg_matrix.tsv מ-DIA-NN ונתוני חלבון משולבים המסתיימים ב-.tsv מ-FragPipe משמשים בדרך כלל לניתוח.</li>
	<li>הסר את הערכים החסרים מבלי למלא NA וסנן את קבוצות החלבון שזוהו וכימתו עם פחות משני פפטידים ייחודיים. הערה: נתוני ה-DIA במחקר זה נוצרו על ידי קבוצות חלבון מסוננות, בעוד שנתוני ה-DDA היו מקבוצות חלבון לא מסוננות.</li>
	<li>נרמל את עוצמות החלבון באמצעות קנה מידה חציוני או נורמליזציה קוונטילית על פני דגימות. נתוני DIA במחקר זה נורמלו על ידי נורמליזציה חציונית ואילו נתוני DDA על ידי נורמליזציה קוונטילית כדי להדגים טוב יותר את שתי השיטות. הערה: נורמליזציה חציונית חזקה כנגד חריגים ומתאימה לתרחישים שבהם רוב החלבונים נשארים ללא שינוי על פני הדגימות, מה שהופך את שפע החלבון החציוני לנקודת ייחוס יציבה. עם זאת, הוא עלול להיכשל בתרחישים עם חלבונים בעלי ביטוי דיפרנציאלי גבוה18. נורמליזציה קוונטילית מבטיחה התפלגות אחידה של שפע החלבון על פני דגימות, מה שמועיל כאשר משווים דגימות עם התפלגויות שונות. הוכח שהוא מפחית את הכוח הסטטיסטי ועלול לנרמל נתונים יתר על המידה, מה שעלול להסוות הבדלים ביולוגיים אמיתיים18. בפרוטאומיקה, נורמליזציה חציונית נמצאת בשימוש נרחב במחקרים ללא תוויות כדי להסיר הטיות שיטתיות הקשורות לביצועי מכשירי טרשת נפוצה. נורמליזציה קוונטילית מועדפת עבור מערכי נתונים בקנה מידה גדול, ניתוח ביטוי דיפרנציאלי וניתוח אשכולות19,20.</li>
	<li>חשב שינויים בקיפול log2 (למשל, סרום PDAC לעומת רגיל) וערכי p של מבחן t. חישוב ערכי p מתוקנים בשיטת בנימיני-הוכברג. הגדר ספי מובהקות (למשל, |log2FC| &gt; 1, p_adj (FDR) &lt; 0.05). הערה: ערכי ה-p החותכים המשמשים בנתוני מחקר זה מייצגים ערכים גולמיים, שכן שימוש בערכי p מותאמים (p_adj) יבטל את כל החלבונים הניתנים לזיהוי בכוח הסטטיסטי של מערכי נתונים מוגבלים אלה.</li>
	<li>בדוק את קיומם של ערכי NA חסרים ואל תכלול אותם. צור עלילת הר געש כדי להמחיש פגיעות משמעותיות.</li>
	<li>בחר חלבונים לא מווסתים באופן משמעותי. החל נורמליזציה של ציון Z על ערכי ביטוי חלבון. שרטט מפת חום מקובצת עם ביאורים של קבוצות לדוגמה.</li>
	<li>מפה חלבונים למזהי Entrez באמצעות org. Hs.eg.db. לבצע העשרת GO (תהליך ביולוגי) וניתוח מסלול KEGG. הערה: קטגוריות תהליך ביולוגי (BP) נבחרות בדרך כלל בניתוח אונטולוגיה גנטית (GO) מכיוון שהן מתארות את התהליכים הגדולים יותר או התוכניות הביולוגיות המושגות על ידי פעילויות מולקולריות מרובות20. מונחים אלה מתמקדים בתפקודים תאיים שמשתבשים במחלות כמו סרטן, כולל תהליכים חיוניים כמו ויסות מחזור התא, תהליכים מטבוליים וכו'. בנוסף ל-BP, ניתוח GO כולל גם קטגוריות תפקוד מולקולרי (MF) ורכיב סלולרי (CC). מונחי MF מתארים את הפעילויות הביוכימיות של תוצרי גנים, כגון הובלת יונים או יכולות קשירת DNA. מונחי CC מגדירים את המיקומים התאיים שבהם תוצרי גנים מבצעים את תפקידיהם, כגון הגרעין, הממברנה המיטוכונדריאלית או השלד הציטולוגי.</li>
	<li>שאילתה STRINGdb עבור אינטראקציות (ניקוד מהימנות ≥ 400). צור רשת אינטראקטיבית באמצעות visNetwork.</li>
</ol>

<ol><li>Pedrioli, P. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+open+representation+of+mass+spectrometry+data+and+its+application+to+proteomics+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A common open representation of mass spectrometry data and its application to proteomics research.</a> Nat Biotechnol. 22 (11), 1459-1466 (2004).</li>
<li>Perez-Riverol, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PRIDE+database+at+20+years%3A+2025+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The PRIDE database at 20 years: 2025 update.</a> Nucl Acids Res. 53 (D1), D543-D553 (2025).</li>
<li>Deutsch, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+Standards+Initiative+at+Twenty+Years%3A+Current+Activities+and+Future+Work%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomics Standards Initiative at Twenty Years: Current Activities and Future Work.</a> J Proteome Res. 22 (2), 287-301 (2023).</li>
<li>Schubert, O. T., Röst, H. L., Collins, B. C., Rosenberger, G., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics%3A+challenges+and+opportunities+in+basic+and+applied+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics: challenges and opportunities in basic and applied research.</a> Nat Protoc. 12 (7), 1289-1294 (2017).</li>
<li>Wang, X., Shen, S., Rasam, S. S., Qu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS1+ion+current-based+quantitative+proteomics%3A+A+promising+solution+for+reliable+analysis+of+large+biological+cohorts%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectro+Rev%22%5BJournal%5D)">MS1 ion current-based quantitative proteomics: A promising solution for reliable analysis of large biological cohorts.</a> Mass Spectro Rev. 38 (6), 461-482 (2019).</li>
<li>Vaudel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS2-Based+Quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Inform%22%5BJournal%5D)">MS2-Based Quantitation.</a> Proteome Inform. , 155-177 (2016).</li>
<li>Meyer, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+Quantitative+Shotgun+Proteomics+Data+Analysis+from+Data-Dependent+Acquisition+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Shotgun+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Qualitative and Quantitative Shotgun Proteomics Data Analysis from Data-Dependent Acquisition Mass Spectrometry.</a> Shotgun Proteomics. 2259, 297-308 (2021).</li>
<li>Fröhlich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data-Independent+Acquisition%3A+A+Milestone+and+Prospect+in+Clinical+Mass+Spectrometry-Based+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Data-Independent Acquisition: A Milestone and Prospect in Clinical Mass Spectrometry-Based Proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 23 (8), 100800(2024).</li>
<li>Zhang, F., Ge, W., Ruan, G., Cai, X., Guo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data-Independent+Acquisition+Mass+Spectrometry-Based+Proteomics+and+Software+Tools%3A+A+Glimpse+in+2020%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Data-Independent Acquisition Mass Spectrometry-Based Proteomics and Software Tools: A Glimpse in 2020.</a> Proteomics. 20 (17-18), 1900276(2020).</li>
<li>Deutsch, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ProteomeXchange+consortium+at+10+years%3A+2023+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The ProteomeXchange consortium at 10 years: 2023 update.</a> Nucl Acids Res. 51 (D1), D1539-D1548 (2023).</li>
<li>Demichev, V., Messner, C. B., Vernardis, S. I., Lilley, K. S., Ralser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIA-NN%3Aneural+networks+and+interference+correction+enable+deep+proteome+coverage+in+high+throughput%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">DIA-NN:neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput.</a> Nat Meth. 17 (1), 41-44 (2020).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparative+Analysis+of+Data+Analysis+Tools+for+Data-Independent+Acquisition+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A Comparative Analysis of Data Analysis Tools for Data-Independent Acquisition Mass Spectrometry.</a> Mol Cell Proteomics. 22 (9), 100623(2023).</li>
<li>Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSFragger%3A+ultrafast+and+comprehensive+peptide+identification+in+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">MSFragger: ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics.</a> Nat Meth. 14 (5), 513-520 (2017).</li>
<li>Anderson, N. L., Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Plasma+Proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The Human Plasma Proteome.</a> Mol Cell Proteomics. 1 (11), 845-867 (2002).</li>
<li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proc Natl Acad Sci. 113 (8), E968-E977 (2016).</li>
<li>Cao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteogenomic+characterization+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Proteogenomic characterization of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cell. 184 (19), 5031-5052.e26 (2021).</li>
<li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteogenomic+characterization+identifies+clinically+relevant+subgroups+of+intrahepatic+cholangiocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Proteogenomic characterization identifies clinically relevant subgroups of intrahepatic cholangiocarcinoma.</a> Cancer Cell. 40 (1), 70-87.e15 (2022).</li>
<li>Dubois, E., Galindo, A. N., Dayon, L., Cominetti, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+normalization+methods+in+clinical+research+applications+of+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%222020+IEEE+Conf+Computat+Intelligence+Bioinfo+Computat+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of normalization methods in clinical research applications of mass spectrometry-based proteomics.</a> 2020 IEEE Conf Computat Intelligence Bioinfo Computat Biol. , 1-10 (2020).</li>
<li>Dressler, F. F., Brägelmann, J., Reischl, M., Perner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normics%3A+Proteomic+Normalization+by+Variance+and+Data-Inherent+Correlation+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Normics: Proteomic Normalization by Variance and Data-Inherent Correlation Structure.</a> Mol Cell Proteomics. 21 (9), 100269(2022).</li>
<li>Dimmer, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Gene+Ontology+-+Providing+a+Functional+Role+in+Proteomic+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The Gene Ontology - Providing a Functional Role in Proteomic Studies.</a> Proteomics. 8 (23-24), pmic.200800002(2008).</li>
<li>Lih, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Pancreatic+Ductal+Adenocarcinoma-Associated+Proteins+in+Serum%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Detection of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma-Associated Proteins in Serum.</a> Mol Cell Proteomics. 23 (1), 100687(2024).</li>
<li>Chinese Human Proteome Project (CNHPP) Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+identifies+new+therapeutic+targets+of+early-stage+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proteomics identifies new therapeutic targets of early-stage hepatocellular carcinoma.</a> Nature. 567 (7747), 257-261 (2019).</li>
<li>Kanehisa, M., Furumichi, M., Sato, Y., Matsuura, Y., Ishiguro-Watanabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KEGG%3A+biological+systems+database+as+a+model+of+the+real+world%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">KEGG: biological systems database as a model of the real world.</a> Nucl Acids Res. 53 (D1), D672-D677 (2025).</li>
<li>Campello, E., Ilich, A., Simioni, P., Key, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+pancreatic+cancer+and+hypercoagulability%3A+a+comprehensive+review+on+epidemiological+and+biological+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">The relationship between pancreatic cancer and hypercoagulability: a comprehensive review on epidemiological and biological issues.</a> Br J Cancer. 121 (5), 359-371 (2019).</li>
<li>Fang, L., Xu, Q., Qian, J., Zhou, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+Factors+of+Fibrinolysis+and+Coagulation+in+Pancreatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22OncoTargets+Ther%22%5BJournal%5D)">Aberrant Factors of Fibrinolysis and Coagulation in Pancreatic Cancer.</a> OncoTargets Ther. 14, 53-65 (2021).</li>
<li>Vlodavsky, I., Elkin, M., Ilan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+heparanase+and+the+tumor+microenvironment+on+cancer+metastasis+and+angiogenesis%3A+basic+aspects+and+clinical+applications+%5BTitle%5D)+AND+%22Rambam+Maimonides+Med+J%22%5BJournal%5D)">Impact of heparanase and the tumor microenvironment on cancer metastasis and angiogenesis: basic aspects and clinical applications .</a> Rambam Maimonides Med J. 2 (1), (2011).</li>
<li>Fröhlich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+of+analysis+strategies+for+data-independent+acquisition+proteomics+using+a+large-scale+dataset+comprising+inter-patient+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Benchmarking of analysis strategies for data-independent acquisition proteomics using a large-scale dataset comprising inter-patient heterogeneity.</a> Nat Comm. 13 (1), 2622(2022).</li>
<li>Polasky, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSFragger-Labile%3A+A+Flexible+Method+to+Improve+Labile+PTM+Analysis+in+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">MSFragger-Labile: A Flexible Method to Improve Labile PTM Analysis in Proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 22 (5), 100538(2023).</li>
<li>Gerault, M. A., Camoin, L., Granjeaud, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIAgui%3A+a+Shiny+application+to+process+the+output+from+DIA-NN%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinfo+Adv%22%5BJournal%5D)">DIAgui: a Shiny application to process the output from DIA-NN.</a> Bioinfo Adv. 4 (1), (2024).</li>
<li>Hsiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+Visualization+of+Quantitative+Proteomics+Data+Using+FragPipe-Analyst%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis and Visualization of Quantitative Proteomics Data Using FragPipe-Analyst.</a> J Proteome Res. 23 (10), 4303-4315 (2024).</li>
<li>Yu, F., Deng, Y., Nesvizhskii, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSFragger-DDA%2B+enhances+peptide+identification+sensitivity+with+full+isolation+window+search%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">MSFragger-DDA+ enhances peptide identification sensitivity with full isolation window search.</a> Nat Comm. 16 (1), 3329(2025).</li>
<li>Li, K., Teo, G. C., Yang, K. L., Yu, F., Nesvizhskii, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((diaTracer+enables+spectrum-centric+analysis+of+diaPASEF+proteomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">diaTracer enables spectrum-centric analysis of diaPASEF proteomics data.</a> Nat Comm. 16 (1), 95(2025).</li>
<li>Qiao, R., Li, H., Bian, H., Xin, L., Shan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Novo+sequencing-assisted+homology+search+for+DIA+data+analysis+enables+low+abundance+peptide+variants+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biorvix%22%5BJournal%5D)">De Novo sequencing-assisted homology search for DIA data analysis enables low abundance peptide variants discovery.</a> Biorvix. 10, (2025).</li>
<li>Meissner, F., Geddes-McAlister, J., Mann, M., Bantscheff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+mass+spectrometry-based+proteomics+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Disc%22%5BJournal%5D)">The emerging role of mass spectrometry-based proteomics in drug discovery.</a> Nat Rev Drug Disc. 21 (9), 637-654 (2022).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-omics+data+integration+using+ratio-based+quantitative+profiling+with+Quartet+reference+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multi-omics data integration using ratio-based quantitative profiling with Quartet reference materials.</a> Nat Biotechnol. 42 (7), 1133-1149 (2024).</li>
<li>Bubis, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenging+the+Astral+mass+analyzer+to+quantify+up+to+5%2C300+proteins+per+single+cell+at+unseen+accuracy+to+uncover+cellular+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Challenging the Astral mass analyzer to quantify up to 5,300 proteins per single cell at unseen accuracy to uncover cellular heterogeneity.</a> Nat Meth. 22 (3), 510-519 (2025).</li>
<li>Leutert, M., Entwisle, S. W., Villén, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+Post-Translational+Modification+Crosstalk+With+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Decoding Post-Translational Modification Crosstalk With Proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 20, 100129(2021).</li>
<li>Schneider, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Scalable%2C+Web-Based+Platform+for+Proteomics+Data+Processing%2C+Result+Storage+and+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">A Scalable, Web-Based Platform for Proteomics Data Processing, Result Storage and Analysis.</a> Proteome Res. 24 (3), 1241-1249 (2025).</li>
<li>Jalili, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Galaxy+platform+for+accessible%2C+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses%3A+2020+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2020 update.</a> Nucl Acids Res. 48 (W1), W395-W402 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>.NET SDK גרסה 9.0.203</td><td>מיקרוסופט</td><td></td><td>https://dotnet.microsoft.com/en-us/download</td></tr><tr><td>DIA-NN גרסה 2.1.0</td><td></td><td></td><td>https://github.com/vdemichev/DiaNN/releases/tag/2.0&nbsp;</td></tr><tr><td>FragPipe v. 22.0</td><td></td><td></td><td>https://github.com/Nesvilab/FragPipe/releases</td></tr><tr><td>MSFileReader v. 3.1&nbsp;</td><td>תרמו פישר</td><td></td><td>https://github.com/thermofisherlsms/MSFileReader/blob/main/MSFileReader_x64.exe</td></tr><tr><td>ר 4.5.0</td><td></td><td></td><td>https://cran.rstudio.com/bin/windows/base/R-4.5.0-win.exe</td></tr><tr><td>Rstudio v. 2024.12.1+563</td><td></td><td></td><td>https://posit.co/download/rstudio-desktop/</td></tr></tbody></table>

ניווט בנתונים פרוטאומיים מבוססי ספקטרומטריית מסה באמצעות כלים חישוביים חינמיים

Navigating the Mass Spectrometry-Based Proteomic Data Using Free Computational Tools

כדי להמחיש טוב יותר את החיפוש אחר מערכי נתונים פרוטאומיים, בחרנו שני סוגים של מערכי נתונים לניתוח זה. במטרה להדגים חלבונים לא מווסתים בהקשרים קליניים, חיפשנו ב-PRIDE באמצעות מילות מפתח כגון קליניקה. באופן ספציפי, בחרנו מערך נתונים המתאים לניתוח DIA מהקונסורציום לניתוח גידולים פרוטאומיים קליניים (CPTAC)21, ואחר המתאים לניתוח DDA מפרויקט הפרוטאום האנושי הסיני (CNHPP)22. בחירות אלה אפשרו הערכה והדגמה מקיפה של יכולות התוכנה בניתוח נתונים פרוטאומ...

Mass spectrometry (MS)-based proteomics data, including Data-Dependent Acquisition (DDA) and Data-Independent Acquisition (DIA), are widely used in ...

navigating-mass-spectrometry-based-proteomic-data-using-free

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים טיהור פפטיד באמצעות הליך STAGE Tip. עמוד מיניאטורי המכיל חרוזי שרף הקשורים לשרשראות פחמימנים ארוכות מאפשר טיהור מבוסס אינטראקציה הידרופובית. עם העמסת דגימת פפטיד מעוכלת מראש לתוך העמודה, שברי הפפטיד נקשרים לחרוזי השרף, ומאפשרים לזיהומים לעבור דרכם. חיץ אלוציה המשבש את האינטראקציה ההידרופובית מוחל כדי להדק את שברי הפפטידים.

הליך STAGE TIP להתפלה וטיהור של פפטידים

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לטיהור זיקה של קומפלקסי חלבונים והפרדה שלהם לפי דף ילידי כחול, ואחריו פרופיל מתאם חלבון באמצעות ספקטרומטריית מסה כמותית בחינם תווית. שיטה זו שימושית כדי לפתור interactomes לתוך מתחמי חלבון ברורים.

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

אנו מציגים פרוטוקול מדויק quantitate חלבונים עם תוויות isobaric, fractionation נרחב, ושפור צעדים בקרת איכות בשילוב עם כרומטוגרפיה נוזלית לממשק כדי בספקטרומטר ברזולוציה גבוהה.

פרוטאום עמוק פרופיל על ידי תיוג Isobaric, מקיף כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטר מסה תוכנה בסיוע כמת

פרוטוקול מפורט מתואר את ההפרדה, זיהוי של אפיון proteoforms דגימות חלבון באמצעות נימי אזור אלקטרופורזה-ספקטרומטריית electrospray יינון-טנדם ספקטרומטר מסה (CZE-ESI-MS/MS). הפרוטוקול יכול לשמש עבור אפיון ברזולוציה גבוהה proteoforms דגימות חלבון וזיהוי בקנה מידה גדול של proteoforms בדגימות פרוטאום מורכבים.

בקנה מידה גדול פרוטאומיקס מלמעלה למטה באמצעות ספקטרומטר מסה של טנדם אלקטרופורזה של אזור נים

OpenProt הוא מסד נתונים ונגיש באופן חופשי אוכף דגם polycistronic של הגנום האיקריוטים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש של מסדי נתונים OpenProt כשחוקרים datasets ספקטרומטר מסה. שימוש OpenProt מסד נתונים לניתוח של ניסויים פרוטיאומיה מבנית מאפשרת גילוי של הרומן וחלבונים בעבר לגילוי.

ניתוחים פרוטאומיקס מבוססי ספקטרומטר מסה משימוש במסד הנתונים OpenProt לחשוף את הרומן חלבונים מתורגם ממסגרות קאנונית קריאה פתוחה

הפרוטוקול BN-MS רב-תכליתי באמצעות מיקרוטומה מוצג ברזולוציה גבוהה complexome פרופיל.

הפרדה ברזולוציה גבוהה בפרופיל מלא-ניתוח בהקפאה בסון-MS

מתוארים היא זרימת עבודה פרוטאומניקה לזיהוי שותפים אינטראקציה חלבונים מתוך שבר גרעיני subcellular באמצעות העשרת זיקה חיסונית של חלבון נתון של ריבית ותוויות המסה חינם התווית. זרימת העבודה כוללת שבירה תת-תאית, immunoprecipitation, סינון הכנה לדוגמה, ניקוי לא מקוון, ספקטרומטר מסה וצינור ביואינפורמטיקה במורד הזרם.

Immunoprecipitation ללא תווית של זרימת עבודה בהיקפים גדולים של החברה ליצירת פרופיל רב-ממדי של Interactome גרעינית

הפרוטוקול המתואר מספק ניתוח פרוטאומי כמותי ממוטב של דגימות רקמה באמצעות שתי גישות: כמות מבוססת תווית וללא תווית. לגישות מבוססות תוויות יש יתרון של כמות מדויקת יותר של חלבונים, בעוד שגישה נטולת תוויות חסכונית יותר ומשמשת לניתוח מאות דגימות של קבוצה.

זרימת עבודה מקיפה של פרוטאומיקת רובה ציד מבוססת ספקטרומטריה של דגימות רקמה

כאן, אנו מקימים שיטה פרוטאומית מבוססת ספקטרומטריית מסה תוך שימוש באזורי עניין מבודדים בקטעי רקמה קבועים בפורמלין, משובצים בפרפין. פרוטוקול זה משמש לניתוח פרוטאום מאזורי רקמה ספציפיים בקטעי רקמה קבועים בפורמלין, משובצים בפרפין.

גישה יעילה לפרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה תוך שימוש באזורי רקמה נבחרים

וידאו זה מדגים את הכנת שכבת מטריצה ​​/ אנליטי דקים לניתוח פפטידים וחלבונים על ידי מטריקס בסיוע לייזר desorption Ionization המוניים ספקטרומטריית (MALDI-MS).

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

למד לנתח נתונים פרוטאומיים מורכבים באמצעות כלים חישוביים חינמיים כמו DIA-NN ו-MSFragger. השיטה מאפשרת זיהוי שינויים בביטוי גנים בסרטן לבלב וכבד, ומסייעת לחוקרים לאמת ממצאים ממאגרי נתונים ציבוריים.

ניווט בנתונים פרוטאומיים מבוססי ספקטרומטריית מסה באמצעות כלים חישוביים חינמיים

גלה סרטונים נוספים