שיפור טכנולוגיית קולטני אנטיגן כימריים-שלפוחיות חוץ-תאיות (CAR-EV): עתיד הטיפול בסרטן

המחקר שלנו מתמקד בפיתוח אבחון וטיפולים מבוססי אקסוזומים. המטרה היא לפתח טיפולים מבוססי אקסוזומים של קולטני אנטיגן כימריים, בטוחים ויעילים ונגישים יותר מטיפולים מבוססי תאים, לטיפול בגידולי לוואי. פלטפורמות EXO-NET ו-EXO-ACE שלנו מאפשרות בידוד אקסוזומים ניתן להרחבה, ניתן לשחזור ותואם GMP עם תפוקה וטוהר גבוהים, תוך מתן מענה למגבלות של שיטות מסורתיות למחקר וטיפול.

EXO_NET נטו ו-EXO-ACE מאפשרים בידוד EV מהיר, ניתן להרחבה ותואם GMP, עם טוהר ושחזור מעולים, ועולים על צנטריפוגה ומשקעים למחקר, אבחון ויישומים טיפוליים. פיתחנו שיטה מהירה, ניתנת להרחבה ומאומתת להנדסת רכבי CAR-EV, ולספק טיפולים ממוקדים מהדור הבא, נטולי תאים. זה מספק זרימת עבודה חזקה שניתן ליישם במצבי מחלה אחרים שבהם יש צורך קליני.

המטרה הבאה שלנו היא להשתמש בשיטות שפיתחנו ואימתנו כדי לייצר CAR-EVs לאספקת טיפולי RNA לטיפול בגידולים מוצקים ומחלות דלקתיות אחרות. כדי להתחיל, הביאו את עמוד חילופי היונים לטמפרטורת החדר על ידי מתן אפשרות לעמוד זקוף למשך 15 דקות. בעזרת פיפטה, הוסף 10 נפחי עמודות של מאגר התחדשות, ואחריהם 10 נפחי עמודות של מאגר שיווי משקל.

העבירו את המדיום המותנה THOD דרך מסנן פוליאתרסולפון בגודל 0.22 מיקרומטר. כעת, הוסף עד 31.2 נפחי עמודות של המדגם המסונן לעמודה המאוזנת. לאחר מכן הוסף 10 נפחי עמודות של מאגר כביסה, ואחריו נפחי 2.5 עמודות של מאגר פליטה.

אסוף את הזרימה דרך הכלת השלפוחיות החוץ-תאיות המועשרות. באמצעות מסננים צנטריפוגליים אולטרה-סינון של 30 קילו-דלטון ומדלל, מבצעים החלפת חיץ על אטיקת השלפוחית החוץ-תאית, ומבטיחים דילול מינימלי פי 100. התאם את הנפח הסופי של הפתרון המוחלף בהתבסס על צרכי הניסוי.

העבירו את דגימת השלפוחית החוץ-תאית המועשרת דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר כדי לעקר אותה לבדיקות מבחנה. קבע את התפלגות הגודל, הריכוז והתפוקה של שלפוחיות חוץ-תאיות CAR באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים. לבידוד שלפוחית חוץ-תאית פאן-אקסוזום בתפוקה גבוהה, הפעל והיכנס למכשיר.

קבע את תצורת ההגדרות כדי ליצור את פרוטוקול בידוד החלבון HT EV. הכן צלחת מסרק קצה על ידי הנחת מסרק קצה לצלחת באר עמוקה של 96 בארות. הוסף מיליליטר PBS לכל באר להכנת שלוש צלחות כביסה.

כעת, הכינו צלחת פליטה על ידי פיפטינג של 35 מיקרוליטר של מאגר SDS של 1% לכל באר של צלחת של 96 בארות. לאחר מכן הכינו צלחת כריכה על ידי הוספת מיליליטר אחד של המדיום המותנה. במערכת הבידוד האוטומטית, התחל את הפרוטוקול על ידי בחירת התוכנית HT EV Protein Isolation Protocol, ובחר בלחצן ההפעלה.

פתח את המכשיר כדי להתחיל בטעינת הלוחות. עקוב אחר הנחיות המכשיר וטען את לוחות השטיפה המוכנים, ולאחר מכן את שלוש צלחות הבאר העמוקות לתוך המכשיר. רגע לפני טעינת לוחית הכריכה, הוסף 30 מיקרוליטר של חרוזי לכידת פאן-אקסוזום לכל באר.

טען את לוחית הכריכה לתוך המכשיר, ולאחר מכן טען את לוחית מסרק הקצה, וסגור את המכשיר כדי להתחיל את הכריכה. המערכת תערבב את הדגימה הבינונית המותנית והחרוזים המגנטיים ברציפות במהירות איטית למשך 30 דקות, מה שיקל על לכידה יעילה של שלפוחיות חוץ-תאיות. עם השלמת שלב הכריכה, אפשר למערכת לבצע שלושה שלבי כביסה, לערבב במהירות איטית למשך 30 שניות כדי להסיר מזהמים לא ספציפיים.

אפשר למערכת האוטומטית ליזום ליזיס שלפוחית חוץ-תאית להתאוששות חלבון על ידי ביצוע ערבוב תחתון של 30 שניות. במהלך הדגירה, המכשיר ישהה למשך שבע דקות ו-30 שניות, תוך שמירה על קצות הפיפטה ממוקמים מעל כל באר. התחל מיקס נוסף של 30=שניות, ואחריו הפסקה נוספת של שבע דקות ו-30 שניות.

כאשר הפרוטוקול יסתיים, המערכת תרים את מסרק הקצה המשומש, ותשאיר את התמיסה בצלחת 96 הבארות ואת החרוזים המגנטיים המחוברים לקצוות. לבסוף, המכשיר ימשיך לשלב השמאל, ויחזיר את מסרק הקצה לתוך לוחית מסרק הקצה. פתח את המכשיר והסר את הלוחות.

פלואורסצנטיות GFP אישרה ביטוי CAR בתאי T מותמרים, עם לוקליזציה ניכרת באשכולות תאים, וקולוקליזציה מאומתת על ידי שכבת תעלות שדה בהיר ו-GFP. ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים חשף ריכוז גבוה משמעותית של שלפוחיות חוץ-תאיות במקטע ה-EV המועשר בהשוואה למדיה מותנית עבור מבני EGFR ו-HER2 CAR. כתמים מערביים אישרו את נוכחותו של גרנזים B בתאים המבטאים CAR ובשלפוחיות החוץ-תאיות המבודדות, כאשר קלנקסין נעדר בשלפוחיות החוץ-תאיות, מה שמעיד על היעדר זיהום תאי.

שלפוחיות חוץ-תאיות CAR המכוונות ל-EGFR הפחיתו משמעותית את כדאיות תאי סרטן השד MCF-7 ב-70% וכדאיות תאי סרטן הדם K-562 ב-40% שלפוחיות חוץ-תאיות של CAR המכוונות ל-HER2 הראו ירידה של כ-10% בכדאיות תאי סרטן השד MCF-7, בעוד שלא הייתה להן השפעה ניכרת על תאי סרטן הדם K-562.