SCAnED - מאקרו פילוח עור בקוד פתוח לזיהוי אוטומטי למחצה של תאים וגרעינים בתאי עור האפידרמיס והעור

בעבודתנו אנו חוקרים מנגנוני רגולציה השומרים על הומאוסטזיס רקמתי ברמות מולקולריות, תאיות, מבניות ומכניות. המטרה שלנו היא להבין מצבים פתולוגיים, כמו דלקת עור או סרטן. עם כלים חדשים להדמיה ברזולוציה גבוהה ומולטיאומיקס, אנו יכולים כעת למפות שינויים בביטוי תאים וגנים ברקמות בדו-ממד ותלת-ממד.

זה באמת דוחף את ההבנה שלנו לגבי איך מחלות מתפתחות ומתפתחות. אחד האתגרים הגדולים כרגע הוא כמות הנתונים העצומה שנוצרת על ידי מיקרוסקופיה מתקדמת. ולמרות שיש יותר כלים לניתוח תמונות, הם לרוב לא ידידותיים למשתמש עבור אנשים ללא הרבה ניסיון, או יקרים למדי.

הפרוטוקול שלנו מציע כלי חינמי וידידותי למשתמש לניתוח תאי עור אנושיים הן באפידרמיס והן בדרמיס. הוא משפר את הדיוק לעומת כלים כלליים, ולא דורש ניסיון קודם בקידוד או בניתוח תמונות. כדי להתחיל, פתח את תמונות האימונופלואורסצנציה בפיג'י או בתמונה J, באמצעות פורמטים ביולוגיים עם הגדרות ברירת מחדל.

אל תחלק את הערוצים בשלב הזה. הורד את מאקרו SCAnED והפעיל אותו על ידי בחירת תוספים. אחר כך מאקרו ולחיצה על הפעלה.

בחר את קובץ סקריפט המאקרו SCAnED כאשר מתבקשים. עקבו אחרי ההוראות שמופיעות על המסך על ידי המקרו. בחר בערוץ E-cadherin כאשר המאקרו מבקש ממנו.

לאחר מכן, נווט לתמונה, בחר adjustment, ואז לכוון ידנית את הסף לערוץ E-cadherin. לחץ על אישור לאחר שהאזור האפידרמלי נתפס במלואו. לאחר מכן בחר בערוץ DAP-E כאשר מתבקשים להמשיך בסגמנטציה.

הגדר אוטומטית את רמות העוצמה לסגמנטציה של הגרעינים בעת שימוש בפונקציית הסף. עבור StarDist, פתח את התוסף ב-Image J.טען את מודל זיהוי הגרעינים לממשק הגרפי של StarDist, ולחץ על ערוץ הגרעינים כדי לבחור אותו לניתוח. עכשיו, כוון את הגדרות האריחים ב-StarDist כך שיתאימו לגודל הפאץ' הצפוי של 256 על 256 פיקסלים.

כאשר מתבקשים, בחר כן כדי למדוד את עוצמת הסמן בתוך הגרעין. לאחר מכן חזרו על תהליך הסגמנטציה והניתוח עבור כל ערוץ פלואורסצנציה. לאחר שכל הערוצים עובדו, שמור את נתוני הפלט כקבצי ערכים מופרדים בפסיקים כפי שנקבע על ידי המקרו.

לאזור ציטופלזמי, כאשר בוצעה סגמנטציה של הגרעינים באמצעות פונקציית הסף, יש להרחיב את אזור הגרעין המעוניין. כאשר StarDist שימש לסגמנטציה של גרעינים, יש להחיל התרחבות לאזור הגרעיני המעניין. בחר כן כאשר מתבקשים למדוד את עוצמת הסמן בכל אזור התא.

לאחר מכן שמרו את קבצי הנתונים שהתקבלו כפורמט ערכים מופרדים בפסיקים לפי הוראות המקרו. קבעו ספי עוצמה ספציפיים לסמן באמצעות דגימות בקרה איזוטיפיות. הורידו את מחברת Jupyter המתאימה, ועברו ל-Google Collab כדי לבחור קובץ, ואחריהם Open Notebook.

בחר את הקובץ והריץ את תאי הקוד ברצף. כאשר מתבקשים עם אפשרות בחירת קבצים, לחצו על הכפתור והעלינו את קובץ הערכים המופרדים בפסיקים. עבור כל נוגדן, יש לחשב את עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת באמצעות קבצי בקרה של האיזוטיפ.

כדי לקבוע את ספי החיתוך, פתח את מחברת הגרף הנקודתי, העלה את נתוני הבקרה של האיזוטיפ, והפעיל את הקוד. בהתבסס על התפלגות הנקודות בגרפים הן עבור בקרת איזוטיפ והן עבור נתוני נוגדנים ספציפיים, יש לבחור סף עוצמה להבחנה בין אות רקע לביטוי סמן אמיתי. השתמש בסף זה כדי לסווג כל תא כחיובי או שלילי עבור הסמן הנתון.

לבסוף, צור גרפים של נקודות כדי להמחיש דפוסי ביטוי משותף של סימנים על ידי הרצת קוד הגרף הנקודה במחברת Google Collab. בתמונות מחולקות ידנית, תאי ויימנטין חיוביים הראו אות ציטופלזמי חזק עם גבולות ROI ברורים המכסים את כל גוף התא. הסגמנטציה החצי-אוטומטית של SCAnED תפסה תאים חיוביים של וימנטין עם גבולות דומים באמצעות גישה של סף והרחבה.

השוואה כמותית של עוצמת וימנטין ב-21 תאים לא הראתה הבדל מובהק בין סגמנטציה ידנית לבין SCAnED. ניתוח היסטוגרמה חשף שכיחות גבוהה יותר של תאי וימנטין חיוביים בדרמיס פסוריאזיס בהשוואה לעור בריא. ניתוח גרף נקודות של תאי עור הראה עלייה בתאי וימנטין חיוביים ל-CD-90 בפסוריאזיס בהשוואה לעור בריא.

באפידרמיס, דגימות פסוריאזיס הראו עלייה בתאי וימנטין שליליים ל-CD-90, ייתכן שקרטינוציטים, בהשוואה לעור בריא. ספירת תאי וימנטין חיוביים באפידרמיס פסוריאטי ובריא הייתה דומה בין SCAnED ל-QuPath. סגמנטציה ויזואלית הראתה ש-SCAnED הקצתה תאי גבול לאפידרמיס בצורה מדויקת יותר מאשר QuPath, שהקצתה כמה מהם בצורה שגויה.