כימות ספיגת חומצות שומן אנדותל באמצעות אנלוגים של חומצות שומן פלואורסצנטיות

חומרים מזינים שמועברים בדם, כמו חומצות שומן, חייבים לעבור מחסום אנדותליאלי נימי כדי להיכנס לרקמה מטבולית דרך מנגנונים שאינם מובנים היטב. הבהרת תהליכים אלו עשויה לחשוף מטרות טיפוליות חדשות לטיפול במחלות מטבוליות, כגון סוכרת סוג 2. לכן מצאנו ששריר הסקלפל ורקמת השומן מווסתים שניהם את קליטת והובלה של שומן האנדותל באמצעות מטבוליטים פרקריניים, שגם הם נשלטים חלקית על ידי המערכת האנדוקרינית.

וגם מצאנו ש-ATP מיטוכונדריאלי תורם באופן בלתי צפוי לספיגת שומן אנדותליאלית למרות התלות הידועה שלהם ב-ATP גליקוליטית. באמצעות הבדיקה המפורטת בפרוטוקול זה, אנו מתכננים לחקור לעומק את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס קליטת והובלה של חומצות שומן אנדותליאליות, כולל כיצד ניתן לווסת אותה על ידי רקמות אחרות. כדי להתחיל, הכינו תמיסת ג'לטין של 0.1% על ידי הוספת 25 מיליליטר של ציר ג'לטין 2% ל-475 מיליליטר של PBS.

ערבבו היטב את תמיסת הג'לטין וחטאו אותה באמצעות פילטר ואקום 0.2 מיקרומטר או אוטוקלאב. באמצעות פיפטה, הוסף 100 מיקרוליטר מתמיסת הג'לטין של 0.1% לכל באר של פלטה שחורה שקופה עם תחתית 96 בארות. הנח את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס לפחות ל-30 דקות או ללילה.

לאחר הדגירה, יש להסיר תמיסת ג'לטין נוספת מהצלחת המצופה מראש עם 96 בארים. שטוף את הצלחת עם PBS פעם אחת. לאחר מכן, הפיפטה של 100 מיקרוליטר של תליית התא לכל באר באמצעות צפיפות זריעה שמאפשרת לתאים להגיע למפגש ביום הבא.

הכינו תמיסות של 20 מילימולר של 3-הידרוקסיאיזובוטיראט ולקטט כאמצעי ביקורת חיוביים. לביקורת שלילית, השתמש בניקלוזמיד מיקרומולר אחד. לאחר מכן, הפיפט את התמיסות ללוח נפרד עם 96 בארים.

שטוף את תאי האנדותל פעם אחת עם PBS דו-ערכית מחומם מראש, תוך פיפטינג בזווית תלולה כדי למנוע הפרעה לתאים המצופים. הוסיפו 50 מיקרוליטר לבאר של התגובה הטיפולית המתאימה ודוגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות או 60 דקות. להכנת קומפלקס חומצות שומן BSA של BODIPY, ערבבו תמיסת חומצות שומן BODIPY באורך 2 מיקרומולרים עם 1 חומצת שומן מיקרומולרית BSA ב-PBS.

דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר בחושך במשך 10 דקות לפני השימוש. לאחר מכן, הוסיפו 50 מיקרוליטר של קומפלקס חומצות שומן BODIPY BSA לכל אחד שטופל היטב ודוגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. הכינו תמיסה מיקרומולרית אחת של BSA ללא חומצות שומן ב-PBS כבופר שטיפה וחממו אותה מראש ל-37 מעלות צלזיוס.

הסר את קומפלקס חומצות השומן BSA של BODIPY מהבארות ושוטף את כל הצלחת פעמיים עם 50 מיקרוליטר של בופר שטיפה מחומם מראש, תוך ביצוע כל שטיפה למשך 1.5 דקות. לאחר מכן, הוסיפו 50 מיקרוליטר של 0.08% כחול טרייפן לכל באר כדי לדכא את הפלואורסצנציה החוץ-תאית. באמצעות קורא מיקרופלט, מדדו מיד פלואורסצנציה תוך-תאית.

לאחר הסרת תמיסת הטרייפן הכחולה מהבארות, שטפו בעדינות את התאים עם PBS. הוסף 4 מיקרוגרם לכל מיליליטר של צבע Hoechst מדולל ב-10% מדיה לכל באר. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

לאחר מכן, שטפו את הצלחת פעם אחת עם PBS כדי להסיר צבע עודף. לאחר מכן, הוסיפו PBS טרי לכל באר ומדדו פלואורסצנציה של Hoechst באמצעות קורא מיקרופלט. בתאי HUVEC ו-EA.hy926, אות BODIPY-C12 התוך-תאי עלה משמעותית עם ריכוזי חומצות שומן גבוהים יותר של BODIPY בדקה אחת, חמש דקות ועשר דקות של דגירה.

טיפול בלקטט במשך שעה הגדיל את קליטת BODIPY-C12 באופן תלוי במינון בריכוזים של 5 מילימולר ו-20 מילימולר. הטיפול ב-3-הידרוקסיאיזובוטיראט גם שיפר משמעותית את ספיגת BODIPY-C12 באופן תלוי במינון, כאשר הספיגה הגבוהה ביותר שנצפתה ב-20 מילימולר. טיפול בניקלוזמיד מיקרומולר אחד למשך 30 דקות הוביל לירידה משמעותית בספיגת BODIPY-C12 בהשוואה לביקורת DMSO לא מטופלת.

לאחר דגירה של חמש דקות עם BODIPY-C16 ב-HUVEC, טיפול בלקטט ב-10 מילימולר ו-20 מילימולר הגביר משמעותית את הקליטה בהתאם למינון. טיפול בניקלוזמיד מיקרומולר אחד הפחית משמעותית את קליטת BODIPY-C16 בהשוואה לביקורת DMSO שלא טופלה.