Name: זיהוי DNA באתר של טפילים טריפנוזומטיים ו-nosema ceranae באמצעות ליזה אלקליין בשילוב עם מערכת RPA/CRISPR/Cas12a (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-18T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: חקור שיטת אבחון מהירה לזיהוי טפילים בדבורים באמצעות RPA ו-CRISPR/Cas12a. השיטה משלבת ליזה אלקליין עם רגישות גבוהה יותר מ-PCR כמותי לזיהוי Lotmaria passim ו-Nosema ceranae.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Goulson, D., Nicholls, E., Botías, C., Rotheray, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bee+declines+driven+by+combined+stress+from+parasites%2C+pesticides%2C+and+lack+of+flowers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bee declines driven by combined stress from parasites, pesticides, and lack of flowers.</a> Science. 347 (6229), 1255957(2015).</li>
<li>Murphy, J. T., Breeze, T. D., Willcox, B., Kavanagh, S., Stout, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globalisation+and+pollinators%3A+pollinator+declines+are+an+economic+threat+to+global+food+systems%5BTitle%5D)+AND+%22People+and+Nature%22%5BJournal%5D)">Globalisation and pollinators: pollinator declines are an economic threat to global food systems.</a> People and Nature. 4 (3), 773-785 (2022).</li>
<li>Zattara, E. E., Aizen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worldwide+occurrence+records+suggest+a+global+decline+in+bee+species+richness%5BTitle%5D)+AND+%22One+Earth%22%5BJournal%5D)">Worldwide occurrence records suggest a global decline in bee species richness.</a> One Earth. 4 (1), 114-123 (2021).</li>
<li>Carreira de Paula, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promastigote+EPS+secretion+and+haptomonad+biofilm+formation+as+evolutionary+adaptations+of+trypanosomatid+parasites+for+colonizing+honeybee+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">Promastigote EPS secretion and haptomonad biofilm formation as evolutionary adaptations of trypanosomatid parasites for colonizing honeybee hosts.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 10 (1), 27(2024).</li>
<li>Requier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+large-scale+study+reveals+important+losses+of+managed+honeybee+and+stingless+bee+colonies+inLatin+America%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">First large-scale study reveals important losses of managed honeybee and stingless bee colonies inLatin America.</a> Sci Rep. 14 (1), 10079(2024).</li>
<li>Babin, A., Schurr, F., Rivière, M. P., Chauzat, M. P., Dubois, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+detection+and+quantification+of+three+microsporidia+infecting+bees%2C+Nosema+apis%2C+Nosema+ceranae%2C+and+Nosema+bombi%2C+using+probe-based+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Protistol%22%5BJournal%5D)">Specific detection and quantification of three microsporidia infecting bees, Nosema apis, Nosema ceranae, and Nosema bombi, using probe-based real-time PCR.</a> Eur J Protistol. 86, 125935(2022).</li>
<li>Cameron, T. C., Wiles, D., Beddoe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+loop-mediated+isothermal+amplification+technologies+for+the+detection+of+honeybee+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Current status of loop-mediated isothermal amplification technologies for the detection of honeybee pathogens.</a> Front Vet Sci. 8, 659683(2021).</li>
<li>Schurr, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+quantitative+real-time+RT-PCR+assays+for+the+detection+of+six+honeybee+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Validation of quantitative real-time RT-PCR assays for the detection of six honeybee viruses.</a> J Virol Methods. 270, 70-78 (2019).</li>
<li>Xu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triplex+real-time+PCR+for+detection+of+Crithidia+mellificae+and+Lotmaria+passim+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Res%22%5BJournal%5D)">Triplex real-time PCR for detection of Crithidia mellificae and Lotmaria passim in honeybees.</a> Parasitol Res. 117 (2), 623-628 (2018).</li>
<li>D'Alvise, P., Seeburger, V., Gihring, K., Kieboom, M., Hasselmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seasonal+dynamics+and+co-occurrence+patterns+of+honeybee+pathogens+revealed+by+high-throughput+RT-qPCR+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Ecol+Evol%22%5BJournal%5D)">Seasonal dynamics and co-occurrence patterns of honeybee pathogens revealed by high-throughput RT-qPCR analysis.</a> Ecol Evol. 9 (18), 10241-10252 (2019).</li>
<li>Shao, G., Zhu, X., Hua, R., Chen, Y., Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+copro-RPA-CRISPR%2FCas12a+assay+to+detect+Echinococcus+granulosus+nucleic+acids+isolated+from+canine+feces+using+NaOH-based+DNA+extraction+method%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Development of a copro-RPA-CRISPR/Cas12a assay to detect Echinococcus granulosus nucleic acids isolated from canine feces using NaOH-based DNA extraction method.</a> PLoS Negl Trop Dis. 18 (12), e0012753(2024).</li>
<li>Xiao, Y., Fei, D., Li, M., Ma, Y., Ma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+application+of+CRISPR-Cas12a-based+recombinase+polymerase+amplification+and+a+lateral+flow+dipstick+and+fluorescence+for+the+detection+and+distinction+of+deformed+wing+virus+types+A+and+B%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Establishment and application of CRISPR-Cas12a-based recombinase polymerase amplification and a lateral flow dipstick and fluorescence for the detection and distinction of deformed wing virus types A and B.</a> Viruses. 15 (10), 2041(2023).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas-OPRAD%3A+a+one-pot+RPA%2FPCR+CRISPR%2FCas12+assay+for+on-site+Phytophthora+root+rot+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cas-OPRAD: a one-pot RPA/PCR CRISPR/Cas12 assay for on-site Phytophthora root rot detection.</a> Front Microbiol. 15, 1390422(2024).</li>
<li>Osmundson, T. W., Eyre, C. A., Hayden, K. M., Dhillon, J., Garbelotto, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back+to+basics%3A+an+evaluation+of+NaOH+and+alternative+rapid+DNA+extraction+protocols+for+DNA+barcoding%2C+genotyping%2C+and+disease+diagnostics+from+fungal+and+oomycete+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">Back to basics: an evaluation of NaOH and alternative rapid DNA extraction protocols for DNA barcoding, genotyping, and disease diagnostics from fungal and oomycete samples.</a> Mol Ecol Resour. 13 (1), 66-74 (2013).</li>
<li>Truett, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+PCR-quality+mouse+genomic+DNA+with+hot+sodium+hydroxide+and+Tris+%28HotSHOT%29%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and Tris (HotSHOT).</a> BioTechniques. 29 (1), 52-54 (2000).</li>
<li>Klintschar, M., Neuhuber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+alkaline+lysis+method+for+the+extraction+of+DNA+from+whole+blood+and+forensic+stains+for+STR+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Forensic+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an alkaline lysis method for the extraction of DNA from whole blood and forensic stains for STR analysis.</a> J Forensic Sci. 45 (3), 669-673 (2000).</li>
<li>Galanis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bee+foraging+preferences%2C+microbiota+and+pathogens+revealed+by+direct+shotgun+metagenomics+of+honey%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">Bee foraging preferences, microbiota and pathogens revealed by direct shotgun metagenomics of honey.</a> Mol Ecol Resour. 22 (7), 2506-2523 (2022).</li>
<li>Xiang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+alkali+lysis+method+for+Plasmodium+falciparum+DNA+extraction+from+filter+paper+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A simple alkali lysis method for Plasmodium falciparum DNA extraction from filter paper blood samples.</a> Mol Biochem Parasitol. , 254(2023).</li>
<li>Shwani, A., Zuo, B., Alrubaye, A., Zhao, J., Rhoads, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+inexpensive+alkaline+method+for+bacterial+DNA+extraction+from+environmental+samples+for+PCR+surveillance+and+microbiome+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Sci%22%5BJournal%5D)">A simple, inexpensive alkaline method for bacterial DNA extraction from environmental samples for PCR surveillance and microbiome analyses.</a> Appl Sci. 14 (1), 141(2024).</li>
<li>Fowler, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+cost-effective%2C+morphology-preserving+method+for+DNA+isolation+from+bulk+invertebrate+trap+catches%3A+tephritid+fruit+flies+as+an+exemplar%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of a cost-effective, morphology-preserving method for DNA isolation from bulk invertebrate trap catches: tephritid fruit flies as an exemplar.</a> PLoS One. 18 (2), e0281759(2023).</li>
<li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12a-mediated+hue-recognition+lateral+flow+assay+for+point-of-need+detection+of+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12a-mediated hue-recognition lateral flow assay for point-of-need detection of Salmonella.</a> Anal Chem. 96 (1), 220-228 (2024).</li>
<li>Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-sensitive+and+rapid+detection+of+pathogenic+Yersinia+enterocolitica+based+on+the+CRISPR%2FCas12a+nucleic+acid+identification+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Foods%22%5BJournal%5D)">Ultra-sensitive and rapid detection of pathogenic Yersinia enterocolitica based on the CRISPR/Cas12a nucleic acid identification platform.</a> Foods. 11 (14), 2160(2022).</li>
<li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+PCR-based%2C+LAMP+and+RPA-CRISPR%2FCas12a+assays+for+the+rapid+detection+of+Diaporthe+aspalathi%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of PCR-based, LAMP and RPA-CRISPR/Cas12a assays for the rapid detection of Diaporthe aspalathi.</a> Int J Mol Sci. 25 (11), 5773(2024).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas12a+combined+with+recombinase+polymerase+amplification+for+rapid+and+sensitive+detection+of+Vibrio+vulnificus+in+one+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas12a combined with recombinase polymerase amplification for rapid and sensitive detection of Vibrio vulnificus in one tube.</a> Acta Biochim Biophys Sin. 55 (2), 322-326 (2023).</li>
<li>Li, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RPA-assisted+CRISPR%2FCas12a+assay+combining+fluorescence+and+lateral+flow+strips+for+the+rapid+detection+of+enterotoxigenic+Bacillus+cereus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">An RPA-assisted CRISPR/Cas12a assay combining fluorescence and lateral flow strips for the rapid detection of enterotoxigenic Bacillus cereus.</a> J Agric Food Chem. 72 (24), 14000-14010 (2024).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-tube+SARS-CoV-2+detection+platform+based+on+RT-RPA+and+CRISPR%2FCas12a%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">One-tube SARS-CoV-2 detection platform based on RT-RPA and CRISPR/Cas12a.</a> J Transl Med. 19 (1), 74(2021).</li>
<li>Aman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iSCAN-V2%3A+a+one-pot+RT-RPA-CRISPR%2FCas12b+assay+for+point-of-care+SARS-CoV-2+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">iSCAN-V2: a one-pot RT-RPA-CRISPR/Cas12b assay for point-of-care SARS-CoV-2 detection.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 800104(2022).</li>
<li>Peng, R., Lu, Z., Liu, M., Hu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RT-RPA-assisted+CRISPR%2FCas12a+for+rapid+and+multiplex+detection+of+respiratory+infectious+viruses+based+on+centrifugal+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Sens+Actuators+B+Chem%22%5BJournal%5D)">RT-RPA-assisted CRISPR/Cas12a for rapid and multiplex detection of respiratory infectious viruses based on centrifugal microfluidics.</a> Sens Actuators B Chem. 399, 134838(2024).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-tube+RPA-CRISPR+Cas12a%2FCas13a+rapid+detection+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">One-tube RPA-CRISPR Cas12a/Cas13a rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Anal Chim Acta. 1278, 341757(2023).</li>
<li>Nguyen, L. T., Smith, B. M., Jain, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+trans-cleavage+activity+of+Cas12a+with+engineered+crRNA+enables+amplified+nucleic+acid+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Enhancement of trans-cleavage activity of Cas12a with engineered crRNA enables amplified nucleic acid detection.</a> Biochemistry. 59 (17), 1474-1481 (2020).</li>
<li>Hao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+lyophilized+CRISPR%2FCas12a+and+RPA+assay+for+rapid+detection+of+Actinobacillus+pleuropneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem+J%22%5BJournal%5D)">Application of a lyophilized CRISPR/Cas12a and RPA assay for rapid detection of Actinobacillus pleuropneumoniae.</a> Microchem J. 206, 111443(2024).</li>
<li>Lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+all-in-one+RPA-Cas12a+strategy+with+de+novo+autodesigner+and+its+application+in+on-site+ultrasensitive+detection+of+DNA+and+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A universal all-in-one RPA-Cas12a strategy with de novo autodesigner and its application in on-site ultrasensitive detection of DNA and RNA viruses.</a> Biosens Bioelectron. 239, 115609(2023).</li>
</ol>

<a href="https://app.jove.com/t/6641">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/68871">10.3791/68874</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/68874">On-site DNA Detection of Trypanosomatid Parasites and Nosema ceranae Through Alkaline Lysis Coupled to RPA/CRISPR/Cas12a System</a>. The Authors&#160;section was&#160;updated.

Erratum: On-site DNA Detection of Trypanosomatid Parasites and Nosema ceranae Through Alkaline Lysis Coupled to RPA/CRISPR/Cas12a System

<table><tbody><tr><td>0.2 מ"ל צינורות אפנדורף נטולי DNA ו-RNAse</td><td>אקסיג'ן</td><td>MTC-02-C</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות אפנדורף נטולי DNA ו-RNAse</td><td>אקסיג'ן</td><td>MTC-150-C</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L טיפים מסוננים עם שמירה נמוכה</td><td>מרפאות מעבדה</td><td>5-063-P5-0</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; L טיפים מסוננים עם שמירה נמוכה</td><td>מרפאות מעבדה</td><td>5-120-פ5-0</td><td></td></tr><tr><td>1000 &mu; L טיפים מסוננים עם שמירה נמוכה</td><td>מרפאות מעבדה</td><td>5-203-פ4-0</td><td></td></tr><tr><td>סדרת BH-200 מחמם בלוק יבש סטיוארט</td><td>קול-פארמר</td><td>EW-36610-00</td><td></td></tr><tr><td>מים שטופלו על ידי DEPC</td><td>אמביקון</td><td>AM9906</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>798681</td><td></td></tr><tr><td>EnGen Lba Cas12a (Cpf1)</td><td>מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד</td><td>M0653T</td><td></td></tr><tr><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>עלי מיקרו-צינור</td><td>פישרברנד</td><td>12141364</td><td></td></tr><tr><td>Milenia GenLine HybriDetect</td><td>Комен</td><td>MGHD 1</td><td></td></tr><tr><td>נאוה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>ערכת RPA TwistAmp נוזלי בסיסי</td><td>טוויסטאמפ</td><td>&nbsp; TALQBAS01</td><td></td></tr><tr><td>להבי אזמל</td><td>סוואן-מורטון</td><td>201</td><td></td></tr><tr><td>יחיד שאנל פיפט PIPETMAN P1000L מיקרופיפטה פליטת מתכת</td><td>גילסון</td><td>F144059M</td><td></td></tr><tr><td>יחיד שאנל פיפט PIPETMAN P100L מיקרופיפטה פליטת מתכת</td><td>גילסון</td><td>F144057M</td><td></td></tr><tr><td>יחיד שאנל פיפט PIPETMAN P10L פליטת מתכת מיקרופיפטה</td><td>גילסון</td><td>F144055M</td><td></td></tr><tr><td>נתרן היפוכלוריט</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>גע במערכת זיהוי PCR בזמן אמת</td><td>ביוראד</td><td>CFX96</td><td></td></tr><tr><td>תריס-הידרוכלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>טוויסטאמפ נוזלי בסיסי</td><td>טוויסט</td><td>TALQBAS01</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי dna באתר של טפילים טריפנוזומטיים ו-nosema ceranae באמצעות ליזה אלקליין בשילוב עם מערכת rpa/crispr/cas12a

On-site DNA Detection of Trypanosomatid Parasites and Nosema ceranae Through Alkaline Lysis Coupled to RPA/CRISPR/Cas12a System

כאן תיארנו שיטה מהירה באתר המשתמשת בליזה אלקליין של בטן דבורים פועלות יחד עם הגברת RPA וזיהוי מבוסס CRISPR/Cas12a על ידי גישות פלואורסצנטיות ו/או זרימה רוחבית. הסכימה של זרימת העבודה המלאה מיוצגת באיור 3, והסכימה של הליזה האלקליין של HotSHOT של בטן דבורים פועלות נמצאת באיור 4. תוצאות מייצגות של בדיקת RPA/CRISPR/Cas12a מוצגות באיור 5. כדי לזהות L. passim ו-N. ceranae, נעשה שימוש בתרמו-ציקלר כדי לכמת את יחידות הקרינה היחסית (RFUs) באמצעות בדיקה המסומנת על ידי FAM (איור 4A). תגובות ה-RPA בוצעו באמצעות 10 ננוגרם של דנ"א, ונתוני הקרינה שורטטו בגרף (איור 4B). בשלב הסופי של הבדיקה, דגימות בצינורות חרוטיים צולמו באמצעות מערכת הדמיית ג'ל (איור 4C). לזיהוי באמצעות בדיקה עם תווית ביוטין, הדגימות הודגרו בתרמובלוק (איור 4A); תמיסת הגילוי הוכנה על פי הוראות היצרן והוחלה על פס זרימה רוחבי (איור 4B, C). השיטה הביאה לזיהוי מוצלח של שני הפתוגנים של דבורי הדבש.
כדי לקבוע את היעילות של תגובות RPA, השווינו שיטה זו עם qPCR סטנדרטי באמצעות DNA מטוהר מדבורי דבש באמצעות הערכה המוזכרת (ראה טבלת החומרים). בסך הכל נבדקו 32 דגימות דבורים עם פריימרים המכוונים לגן β-טובולין של L. passim עבור שתי השיטות ולאחר מכן זוהו על ידי CRISPR/Cas12a trans-vacapage של בדיקות פלואורסצנטיות. יש לציין כי כתוצאה מכך, 12 דגימות נמצאו חיוביות על ידי qPCR, בעוד ש-RPA/CRISPR/Cas12a זיהו L. passim ב-16 דגימות (איור 5A). זה מצביע על כך שביצועי תגובת RPA רגישים יותר מ-PCR, כשיטת הגברת ה-DNA בתקן הזהב.
כמו כן, קבענו את גבול הזיהוי (LOD) עבור qPCR ו-RPA בשילוב עם זיהוי CRISPR/Cas12a עבור L. passim DNA כמודל הפתוגן באמצעות דילולים סדרתיים של L. passim DNA הנעים בין 66 ננוגרם ל-6 fg. qPCR זיהה רק 6 pg, המקביל לכ-96 טפילים (איור 5B). לשם השוואה, ה-LOD עבור RPA תואם ל-96 טפילים (איור 5C, D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig1.jpg"> 
איור 1: זרימת עבודה כללית של הליזיס האלקליין HotSHOT יחד עם הגברת RPA ושיטות זיהוי Cas12 בדבורי דבש. קיצורים: RPA = הגברת פולימראז רקומבינאז; CRISPR = חזרות פלינדרומיות קצרות מקובצות במרווחים קבועים; Cas = חלבון הקשור ל-CRISPR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig2.jpg"> 
איור 2: עיבוד ליזה של תאים מוכנים להגברה עם מאגר HotSHOT. (A) חתכו את בטן דבורת הדבש בעזרת אזמל והכניסו אותה לצינור צנטריפוגה; (B) עם עלי, הכינו השריה עם 400 מיקרוליטר של HotShot; (ג) לדגור על תרמובלוק בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות; ו-(D) לנטרל עם 400 מיקרוליטר של 40 מ"מ Tris-HCl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig3.jpg"> 
איור 3: זרימת עבודה כללית להכנת אנזים Cas12a ופתרונות בדיקה מדווחים עם תווית FAM וביוטין. קיצורים: DEPC-water = מים שטופלו בדיאתיל-פירוקרבונט; crRNA = RNA CRISPR; Cas12 = סוג של חלבון הקשור ל-CRISPR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig4.jpg"> 
איור 4: זיהוי של Lotmaria passim ו-Nosema ceranae. בשיטת CRISPR/Cas12a עם בדיקות FAM וביוטין. לזיהוי FRA, (A) דגימות מודגרות ב-thermocycler; (B) יחידות הקרינה היחסית (RFU's) של L. passim ו-N.ceranae; (ג) הדמיה של אותן דגימות תחת מערכת תיעוד תמונות. בבדיקות ביוטין, (א) דגימה שדוגרת בבלוק תרמו; (ב) דגימות נוספו בסטריפ חיסוני מהערכה (ראו טבלת החומרים); (ג) התוצאות לאחר הדגירה. קיצורים: LP= Lotmaria passim; NC = Nosema ceranae; NTC= אין בקרת תבנית; RFU: יחידות פלואורסצנטיות יחסיות <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig5.jpg"> 
איור 5: השוואה בין qPCR ל-RPA, וגבול הגילוי של Lotmaria passim. (A) איתור L. passim בדגימות דבורי דבש באמצעות qPCR ו-RPA קונבנציונליים. (B) מגבלת זיהוי qPCR של L. passim באמצעות SsoFast EvaGreen. (C) גבול זיהוי של L. passim באמצעות CRISPR/Cas12a עם בדיקה עם תווית FAM; (D) הדמיה של אותו זיהוי CRISPR/Cas12a ( מ-C) תחת מערכת הדמיית ג'ל (שורה עליונה), ותוצאות זרימה רוחבית תואמות באמצעות CRISPR/Cas12a עם בדיקה עם תווית ביוטין (שורה תחתונה). קיצורים: RPA = הגברת פולימראז רקומבינאז; qPCR = תגובת שרשרת פולימראז כמותית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>מגיב</td>
			<td>ריכוז סופי</td>
			<td>10 מיקרוליטר</td>
			<td>50 מיקרוליטר</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x מאגר תגובה</td>
			<td>1x</td>
			<td>5 מיקרוליטר</td>
			<td>25 מיקרוליטר</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs (10 מ"מ)</td>
			<td>1.8 מ"מ</td>
			<td>1.8 מיקרוליטר</td>
			<td>9 מיקרוליטר</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x מיקס אלקטרוני בסיסי</td>
			<td>1x</td>
			<td>1 מיקרוליטר</td>
			<td>5 מיקרוליטר</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>פריימר קדימה (10 μM)</td>
			<td>480 ננומטר</td>
			<td>0.5 מיקרוליטר</td>
			<td>2.4 מיקרוליטר</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>פריימר הפוך (10 μM)</td>
			<td>480 ננומטר</td>
			<td>0.5 מיקרוליטר</td>
			<td>2.4 מיקרוליטר</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>תערובת תגובת ליבה 20x</td>
			<td>1x</td>
			<td>0.5 מיקרוליטר</td>
			<td>2.5 מיקרוליטר</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC מים</td>
			<td>--</td>
			<td>0.7 מיקרוליטר</td>
			<td>3.7 מיקרוליטר</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1: רכיבי Mastermix עבור RPA עם נפחים סופיים של 10 μL ו-50 μL, וריכוזי עבודה מתאימים:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>מגיב</td>
			<td>ריכוז סופי</td>
			<td>תגובת 10 מיקרוליטר</td>
			<td>תגובת 50 מיקרוליטר</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>280 מ"מ MgOAc</td>
			<td>1.8 מ"מ</td>
			<td>0.5 מיקרוליטר</td>
			<td>2.5 מיקרוליטר</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>דנ א</td>
			<td>10-0.1 ננוגרם</td>
			<td>1 מיקרוליטר</td>
			<td>2 מיקרוליטר</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 2: נפח ריאגנטים שיש להוסיף לכל דגימה בתגובה של RPA
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>מגיב</td>
			<td>[מלאי]</td>
			<td>[סופי]</td>
			<td>1x (μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>אנזים Cas12a</td>
			<td>1 מיקרומטר</td>
			<td>50 ננומטר</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cRNA</td>
			<td>1 מיקרומטר</td>
			<td>100 ננומטר</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>בדיקת FAM</td>
			<td>10 מיקרומטר</td>
			<td>250 ננומטר</td>
			<td>1.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מאגר NEB 10x</td>
			<td>פי 10</td>
			<td>1x</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מגבר RPA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מים</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>32.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>סך</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 3: ריכוזי ריאגנטים ליצירת תערובת של זיהוי FAM בשיטת CRISPR/Cas 12a. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>מגיב</td>
			<td>[מלאי]</td>
			<td>[סופי]</td>
			<td>1x (μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>אנזים Cas12a</td>
			<td>1 מיקרומטר</td>
			<td>50 ננומטר</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cRNA</td>
			<td>1 מיקרומטר</td>
			<td>100 ננומטר</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>בדיקת ביוטין</td>
			<td>10 מיקרומטר</td>
			<td>500 ננומטר</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מאגר NEB 10x</td>
			<td>פי 10</td>
			<td>פי 1</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מגבר RPA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מים</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>סך</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 4: ריכוזי ריאגנטים ליצירת תערובת של זיהוי ביוטין בשיטת CRISPR/Cas 12a.

זיהוי DNA באתר של טפילים טריפנוזומטיים ו-nosema ceranae באמצעות ליזה אלקליין בשילוב עם מערכת RPA/CRISPR/Cas12a

Early on-site detection of microscopic pathogens is essential for the effective management and health of honeybee colonies. Currently, the gold standard ...

on-site-dna-detection-trypanosomatid-parasites-nosema-ceranae-through

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סוכן Trypanosoma cruzi Chagas המחלה מייצרת לטווח ארוך ללא תסמינים זיהומים בפתאומיות להתפתח פתולוגיה רפואית מוכרת. פרוטוקול המחקר הבאים מתאר הקצר על בסיס משפחתי אפידמיולוגיים מחקר כדי לפענח את הזיהום טי cruzi מחלות מהאב את רומא.

העברה מינית של Trypanosomes האמריקאי של זכרים ונקבות כדי החברים נאיבי

שאיפה מחט פיין היא טכניקה, לפיו התאים מתקבלים מפצע או איבר באמצעות מחט דקה. חומר מנושפי מרוח, מוכתם ונבדק תחת מיקרוסקופ לאבחון או משמש לביולוגיה מולקולרית, לצילנסה או לניתוח מבחנה. הוא זול, פשוט, מהיר וגורם לטראומה מינימלית.

איתור של Extravascular טריאנוסומה טפילים על ידי שאיפה מחט פיין

מאמר זה מפרט פרוטוקול לזיהוי מהיר של indels המושרה על ידי CRISPR / Cas9 ובחירה של קווים מוטנטיים יתוש Aedes aegypti באמצעות ניתוח נמס ברזולוציה גבוהה.

זיהוי איdel בעקבות MUtagenesis CRISPR/Cas9 באמצעות ניתוח נמס ברזולוציה גבוהה aedes aegypti יתוש

העבודה הנוכחית מתארת את השלבים לייצור qPCR מוכן לשימוש עבור זיהוי DNA T. cruzi שניתן לטעון מראש על כלי התגובה ולאחסן במקרר במשך מספר חודשים.

qPCR מוכן לשימוש לזיהוי דנ"א מטריפנוזומה קרוזי או אורגניזמים פתוגניים אחרים

בעבודה זו פותחה שיטת זיהוי מהירה, רגישה וניידת עבור Candidatus Liberibacter asiaticus המבוססת על הגברה של רקומבינאז פולימראז בשילוב עם CRISPR-Cas12a.

זיהוי קנדידטוס ליבריבקטר אסיאטיקוס הניתן לפריסה בשטח באמצעות הגברה של רקומבינאז פולימראז בשילוב עם CRISPR-Cas12a

אנו מציגים פרוטוקול המשלב הגברה של רקומבינאז פולימראז עם מערכת CRISPR/Cas12a לאיתור עקבות של נגיפי DNA ובונים מיקרוסקופ סמארטפון נייד עם סיווג בעזרת בינה מלאכותית לזיהוי נגיפי DNA נקודתיים.

מערכת זיהוי וירוסי DNA מבוססת על RPA-CRISPR/Cas12A-SPM ולמידה עמוקה

כאן, אנו מציגים את ההכנה שלב אחר שלב של הגברה איזותרמית מבוססת רקומבינאז מעורבבת מראש, ליופילית ותגובות מבוססות Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), אשר ניתן להשתמש בהן לזיהוי סמנים ביולוגיים של חומצות גרעין של פתוגנים של מחלות זיהומיות או סמנים גנטיים אחרים בעלי עניין.

אבחון מבוסס קריספר נקודתי עם ריאגנטים מעורבבים מראש ומיובשים בהקפאה

כדי להקל על הזיהוי המהיר והמדויק של Acinetobacter baumannii, אנו מציגים פרוטוקול המשתמש בהגברה רקומבינאז פולימראז (RPA) בשילוב עם אנדונוקלאז LbaCas12a לזיהוי זיהומי A. baumannii .

זיהוי מהיר וספציפי של זיהומי אצינטובקטר באומני באמצעות הגברת פולימראז רקומבינאז/מערכת מבוססת Cas12a

בפרוטוקול זה, מבחן CRISPR/Cas12a משולב להגברת פולימראז רקומבינאז מודגם לזיהוי הפתוגן הצמחי הפולש, Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical race 4.

בדיקת הגברה משולבת של פולימראז רקומבינאז CRISPR/Cas12a לאיתור Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4

המלכודת קשורה כרומוזום (ACT) assay היא שיטה חדשנית לזיהוי משוחדת ארוכי טווח אינטראקציות-DNA. אפיון האינטראקציות DNA ארוך טווח תאפשר לנו לקבוע את הקשר של האדריכלות גרעינית ביטוי גנים בפיזיולוגיה הן נורמליות במדינות חולה.

כרומוזום מלכודת הידיעות AP עבור זיהוי לטווח ארוך אינטראקציות DNA

חקור שיטת אבחון מהירה לזיהוי טפילים בדבורים באמצעות RPA ו-CRISPR/Cas12a. השיטה משלבת ליזה אלקליין עם רגישות גבוהה יותר מ-PCR כמותי לזיהוי Lotmaria passim ו-Nosema ceranae.

זיהוי DNA באתר של טפילים טריפנוזומטיים ו-nosema ceranae באמצעות ליזה אלקליין בשילוב עם מערכת RPA/CRISPR/Cas12a

גלה סרטונים נוספים