שבב מיקרופלואידי עבור מודלים של פגיעות אקסונליות בנייה ומאפשר ניתוח מולטי-אומיקס

פיתחנו שבבים מיקרופלואידיים בקנה מידה גדול כדי לאפשר ניתוח מולטיומיקה, במטרה להמחיש את המנגנון המטבולי של נוירונים לאחר פגיעה אקסונלית. אנו משתמשים בעיקר בטכנולוגיה מיקרופלואידית, ניתוח שטף מטבולי והטרנסקריפטומיקה כדי לקדם את המחקר על המנגנונים המטבוליים של נוירונים במהלך פגיעה אקסונלית והתחדשות. מצאנו שישנם הבדלים מטבוליים בין תאי עצב בקליפת המוח במחלות התפתחותיות שונות, וכי נוירונים צעירים עוברים שיפוץ מטבולי לאחר פגיעה חיצונית.

היתרון המרכזי של הפרוטוקול שלנו טמון בתכנון הפלטפורמה המיקרופלואידית בקנה מידה גדול יותר ובסטנדרטים התפעוליים, המאפשרים מולטיומיקה מדויקת וגודל של מיליוני תאים. כדי להתחיל, העבר את בסיס ה- PDMS וחומר הריפוי לצינור צנטריפוגה. מניחים את צינור הצנטריפוגה המכיל את התערובת לתוך מערבל מערבל צנטריפוגלי.

צנטריפוגה בחום של 2, 000 גרם למשך ארבע דקות פעמיים לערבב ולהוציא גז. יוצקים 13 עד 15 גרם מה-PDMS נטול הגז לתוך התבנית המיקרופלואידית, ומוודאים שתחתית התבנית מכוסה לחלוטין. כעת, הנח את התבנית במייבש ואקום, ולאחר מכן השתמש במשאבת ואקום כדי לפנות אוויר למשך חמש עד 10 דקות כדי להסיר ביסודיות בועות מה-PDMS.

בעזרת נורת גומי, הקש בעדינות על פני השטח של ה-PDMS כדי לשבור את כל בועות השטח שנותרו. מעבירים את התבנית לתנור הסעה ואופים בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך 100 דקות לריפוי הפולידימתילסילוקסן. לאחר שה-PDMS נרפא במלואו, החלק בעדינות את קצה האזמל מתחת לקצה ה-PDMS כדי להרים ולהפריד אותו בזהירות מהתבנית.

בעזרת אגרוף ביופסיה בקוטר של 2.0 עד 2.5 מילימטרים, צור חורים ב-PDMS לעירוי מדיום תרבית והעמסת תאים. הסר את כל זיהומי פני השטח מה-PDMS באמצעות סרט דבק, ולאחר מכן הניח אותו בכלי זכוכית נקי ועטוף אותו בנייר אלומיניום לאחסון. לפני הניסוי, חיטוי המכשיר המיקרופלואידי ב-121 מעלות צלזיוס ו-101 קילופסקל למשך חמש דקות כדי להבטיח סטריליות.

הניחו תלוש כיסוי המיועד למכשירים מיקרופלואידיים קונבנציונליים בצלחת תרבית של 35 מילימטר. הוסף למנה שני מיליליטר של 0.1 מיליגרם למיליליטר תמיסת פולי-D-ליזין. דגרו את המנה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שש שעות או למשך הלילה.

לאחר הדגירה, יש לשלוף בזהירות את תמיסת הפולי-D-ליזין לשימוש חוזר או לסילוק נכון. כעת, הוסיפו למנה שני מיליליטר מים סטריליים טהורים במיוחד. סובב אותו 50 פעמים בכיוון השעון, ואחריו 50 פעמים נגד כיוון השעון.

שאפו את המים באמצעות משאבת ואקום המחוברת לקצה פיפטה סטרילי, ואספו פסולת במיכל פסולת נוזלית. לאחר השלמת כל השטיפות, הניחו להחלקות הכיסוי להתייבש באוויר באופן טבעי בארון בטיחות ביולוגית לפני השימוש. בעזרת מלקחיים סטריליים עם קצה עדין, הנח את השבב המיקרופלואידי החיטוי במרכז משטח הזכוכית כאשר מיקרו-תעלות פונות כלפי מטה.

לחץ בעדינות את השבב על משטח הזכוכית באמצעות קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר כדי להבטיח הידבקות מלאה. לאחר מכן, סמן את החדר השמאלי בנקודה באמצעות טוש קבוע כדי לייעד את תא הסומה. שאפו 10 מיקרוליטר של מתלה עצבי עם פיפטה של 10 מיקרוליטר, ואז הוצאו לאט את המתלה לפתח הטעינה מעל תא הסומה המסומן.

אשר זרימת נוזלים תקינה למאגר התחתון של החדר השמאלי. העבירו את צלחת התרבות לחממה לחה המוגדרת על 37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני למשך 20 דקות. לאחר הדגירה, הניחו את המנה מתחת למיקרוסקופ פי 20 כדי לאשר שפע מדיה מתא הסומה לתא האקסונלי דרך המיקרו-ערוצים.

כעת, פיפטה 150 מיקרוליטר של מדיום בסיסי עצבי ליציאה העליונה של התא האקסונלי. באופן דומה, הוסף 150 מיקרוליטר של מדיום עצבי שלם ליציאה העליונה של תא הסומה. לאחר מכן, שפכו 20 מיליליטר מים טהורים במיוחד לכלי תרבות של 150 מילימטר ליצירת תא לחות.

מניחים את צלחת התרבות בגודל 35 מילימטר בתוך המנה הגדולה, ואז מעבירים את כל מערכת התרבות לחממה ושומרים למשך הזמן הנדרש. השתמש בצלחת פטרי ברוחב 10 ס"מ למיקום המכשיר המיקרופלואידי בקנה מידה גדול. בחר זריעת ערוץ מלא או מרווח על סמך צרכי הניסוי, מכיוון שכל שיטה דורשת פרוטוקולי פגיעה אקסונליים שונים.

לאחר השלמת הזריעה, הוסף חמישה מיליליטר של מדיום תרבית נוירונים שלם לצלחת פטרי כדי לשמור על צמיחת הנוירונים. העבירו כמות מתאימה של מדיום בסיסי עצבי לצינור צנטריפוגה חדש של 15 מיליליטר לשימוש מאוחר יותר. הניחו מכשיר מיקרופלואידי, המכיל נוירונים בקליפת המוח, על ספסל נקי.

בעזרת נייר נטול מוך, יבש את החלק התחתון של צלחת התרבית בגודל 35 מילימטר, ולאחר מכן השתמש בפיפטה של 200 מיקרוליטר כדי לשאוב את המדיום משני החורים בצד ימין של המכשיר המיקרופלואידי. לאחר מכן, חבר צינור משאבת ואקום לקצה פיפטה סטרילי ונטול פילטר של 200 מיקרוליטר. הפעל את משאבת הוואקום בקצב יניקה של 60 ליטר לדקה וכוון את הקצה לנקודת החיבור בין החור התחתון של תא מסוף האקסון לתא כדי לשאוב את המדיום הישן, ולגרום לשבירת אקסון עקב לחץ שלילי.

החזר את קצה הפיפטה למקומו ושאב 150 מיקרוליטר של מדיום בסיסי עצבי, והוסף אותו לאט לאט דרך החור התחתון של החדר הימני. לאחר ביצוע התוספת והשאיפה ארבע פעמים, החלף במדיום עצבי שלם טרי, ואז שאב את המדיום הישן מהחור הצדדי של גוף התא והוסף מדיום עצבי שלם טרי המכיל תרופות במידת הצורך. מניחים את המכשיר המיקרופלואידי יחד עם צלחת התרבות בצלחת תרבית של 150 מילימטר וממשיכים בתרבות למשך הזמן הנדרש, כגון 24 שעות.

עבור פגיעה אקסונלית ידנית, זרעו נוירונים לכל החדרים של המכשיר המיקרופלואידי בקנה מידה גדול. דגרו את המכשיר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה לחה עם 5% פחמן דו חמצני למשך שלושה ימים. ביום השביעי במבחנה, הוציאו את צלחת התרבית המכילה את המכשיר המיקרופלואידי מהחממה והניחו אותה על במה סטרילית.

הכן מיקרוסקופ עם הגדלה פי 20 ועקר את אזור העבודה באמצעות אתנול 75%. החזיקו קצה פיפטה סטרילי מסונן בנפח 10 מיקרוליטר וזהו צרורות אקסונים במיקרו-ערוצים המקוריים בהנחיית מיקרוסקופ. בצע שריטות אורכיות לאורך כל צרור אקסונים באמצעות קצה הפיפטה.

התבונן בשבירת האקסון מתחת למיקרוסקופ בזמן אמת. המיקרו-ערוצים של מכשיר מיקרופלואידית סטנדרטי מאפשרים צמיחה של אקסונים, אך לא סומה, כפי שאושר על ידי צביעת בטא שלוש טובולין לאחר שבעה ימים במבחנה. צפיפות עצבית לא הראתה הבדל משמעותי לאחר פגיעה אקסונלית, מה שמצביע על מוות עצבי שניתן להבחין בו.

מכשיר מיקרופלואידיקה בקנה מידה גדול עם עיצוב תלת מימדי הניתן להרחבה פותח עבור אנליזות מולטיומיקה. העתקי PDMS לא מנוקבים ומחוררים נדבקו היטב לצלחות של 10 סנטימטר או ללוחות PC. נזק אקסונלי שנגרם על ידי גירוד בקצה הפיפטה הוביל לאקסונים מנותקים בבירור עם מורפולוגיה משובשת, בניגוד לאקסונים שלמים לפני הפציעה.

התחדשות אקסונלית נצפתה הן בשש שעות והן ב-24 שעות לאחר הפציעה, בעוד שאקסונים שלא נפגעו נותרו יציבים. ריכוז החלבון העצבי עלה באופן משמעותי מ-1420.4 מיקרוגרם למיליליטר בנקודת ההתחלה ל-1748.9 למיליליטר לאחר שש שעות, ו-1823.7 מיקרוגרם למיליליטר ב-24 שעות לאחר הפציעה. תפוקות ה-RNA מקבוצות הביקורת והאקסונים שנפגעו היו כמעט זהות.

ריצוף RNA חשף 595 גנים ספציפיים לפגיעה ו-609 גנים ספציפיים לביקורת, עם 17,471 גנים משותפים בין הקבוצות. ניתוח מסלול KEGG זיהה ויסות משמעותי של זרחון חמצוני, תגובת מיני חמצן תגובתיים, אוטופגיה ומסלולי מחזור TCA לאחר פציעה.