הערכת התערבויות טיפוליות במודל העכבר חסר SHIP של אילייטיס ופיברוזיס דמויי מחלת קרוהן

אנו משתמשים בעכברים חסרי SHIP כדי לחקור את המנגנונים המניעים דלקת מעיים ופיברוזיס במחלת קרוהן ולהעריך תרופות חדשות או אסטרטגיות טיפוליות לטיפול במחלת קרוהן. לכן השתמשנו במודל זה במחקרים פרה-קליניים כדי להראות את היעילות של תרופות גליקוגן IBD למתן תרופות ממוקדים. הפרוטוקול שלנו משתמש בעכברים חסרי SHIP, שמפתחים באופן טבעי דלקת אילית ופיברוזיס, ומספקים מודל פיזיולוגי רלוונטי יותר מאשר מודלים כימיים מסורתיים או מבוססי פציעות.

הממצאים שלנו קובעים שעכברים חסרי SHIP כמודל חזק לדלקת איליאלית ופיברוזיס, המאפשר מחקרים מכניים ובדיקות פרה-קליניות לטיפולים למחלת קרוהן. כדי להתחיל, צם את העכברים במשך ארבע שעות לפני ביצוע הבדיקה. המיס ארבעה קילו-דלטון FITC-dextran ב-PBS סטרילי כדי להגיע לריכוז סופי של 80 מיליגרם למיליליטר.

לאחר מכן, הרסן בעדינות כל עכבר והזריק 150 מיקרוליטר של תמיסת FITC-dextran באמצעות שיבוש אוראלי, ואז להשאיר את העכברים ללא אוכל במשך ארבע שעות נוספות לאחר הגלייג'. לאחר המתת חסד לעכבר, מבצעים ניקוב לב באמצעות מחט 25 גייג' ומזרק של מיליליטר לאיסוף דם. מיד הוסיפו 10 מיקרוליטר של תמיסת חומצה-ציטראט-דקסטרוז לכל 100 מיקרוליטר דם שנאסף כנוגד קרישה.

ערבבו היטב על ידי הפיכת הצינור מספר פעמים. צנטריפוגה אספה דגימות דם בטמפרטורה של 1,500 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. העבר בזהירות את הפלזמה לצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.7 מיליליטר מסומנים.

שמור את כל הדגימות על הקרח ומוגן מאור עד שהן מוכנות לניתוח. כעת, מדלל כל דגימת פלזמה ביחס של אחד לשניים ואחד עד עשר באמצעות PBS. הוסיפו 100 מיקרוליטר מכל דילול פלזמה ללוח אטום עם 96 בארות, והניחו אותם בבארות כפולות.

בצע דילול סדרתי אחד או שניים של המלאי המקורי של 80 מיליגרם למיליליטר FITC-dextran באמצעות PBS להכנת ריכוזים שונים של התמיסה. הוסף 100 מיקרוליטר מכל דילול לבארות כפולות של לוח 96 בארות. לאחר מכן, מדדו פלואורסצנציה באמצעות קורא מיקרופלט שמוגדר ל-485 ננומטר לעירוור ו-535 ננומטר לפליטה.

לאחר איסוף דם לבדיקת FITC-dextran, יש לכרות בזהירות את כל המעי הדק מהעכבר. הסר בעדינות כל שומן ורקמת חיבור מהמעי. הנח את המעי הנקי שטוח על דף נייר לבן ריק כדי לשפר את הניגודיות הוויזואלית.

בדקו את הרקמה ויזואלית לסימנים מקרוסקופיים של מחלה, תוך תשומת לב מיוחדת ל-10 הסנטימטרים הרחוקים בעכברי SHIP knockout, שם מתרחשת דלקת לעיתים קרובות. יישר את המעי לצד סרגל כדי לספק קנה מידה וצלם את כל הדגימה כדי לתעד כל ממצא פתולוגי חמור. שטפו בעדינות את הלומן המעי עם PBS באמצעות מזרק להסרת תכולת המעי תוך הימנעות מכוח מופרז כדי למנוע עיוות של הווילוס וארכיטקטורת הקריפטה.

זהה את האזור של האילאום הדיסטלי המייצג ביותר את הפתולוגיה הגסה וכריתת כ-1 סנטימטר רקמה. הנח את הרקמה שנכרתה שטוחה בתוך קלטת היסטולוגיה ומניח אותה בין שני ספוגים כדי למנוע קיפול במהלך הקיבוץ. לצביעת המטוקסילין ואאוזין ולצביעת טריכרום של מסון, קיבעו את הרקמה בפורמלין ניטרלי עם 10% בופר תוך שימוש ב-10 עד 20 פעמים נפח הרקמה בלילה בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר הקיבוע, העבר את הקלטות ל-70% אתנול לאחסון ווודא שהן נשארות שקועות לחלוטין עד לעיבוד. לצביעת חומצה-שיף תקופתית וכחולה אלציאנית, קיבעו את הרקמה בתמיסת קרנוי למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הקיבוע, העבר את הקסטות ל-100% אתנול לאחסון עד לעיבוד.

לאחר מכן, הטמיעו את הרקמות הקבועות בפרפין וחתכו אותן לפרוסות של חמישה מיקרומטר לצביעה הבאה. יש לדרג את חתכי האילאל המוצבעים בהמטוקסילין ובאאוזין באמצעות סולם של 16 נקודות לפי קריטריונים היסטופתולוגיים מוגדרים. הערכו את חתכי הרוחב הצבועים בטריכרום של מסון באמצעות סולם של שש נקודות המבוסס על קריטריונים מוגדרים מראש.

חשב את הציון הסופי של הפיברוזיס כממוצע הציונים שהוקצו על ידי שני סוקרים עצמאיים העיוורים לתנאי הניסוי. לאחר ניתוח והסרת דגימת ההיסטולוגיה, אספו את החלק הנותר של 10 הסנטימטרים הדיסטליים של האילאום. לטשטש את הרקמה שנאספה לייבש עם מגבת נייר או מגבון ללא סיבים, ואז רשמו את משקל הרקמה באמצעות משקל מכויל.

הקפאת הרקמה בחנקן נוזלי לפני שמאחסנת אותה בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס לעיבוד עתידי. כאשר הם מוכנים לעיבוד, שלפו את הרקמה הקפואה ושמרו אותה תמיד על קרח. לאחר מכן, שקלו שוב את דגימות הרקמה כדי לוודא את המסה המדויקת.

הכינו את בופר ההומוגניזציה על ידי הוספת מעכב פרוטאז ל-PBS. השתמש ב-10 מיקרוליטר של בופר לכל מיליגרם רקמה. באמצעות הומוגניזר שולחני, הומוגניזציה של רקמת האילאל בעובי מלא בבופר הומוגניזציה קר.

המשך עד שההומוגנט יהיה אחיד ונקי מחלקי רקמה גלויים. שטוף היטב את קצה ההומוגניזר עם PBS בין דגימות כדי למנוע זיהום צולב. בצנטריפוגה הרקמה מתאחדת ב-10,000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

מחלקים את הסופרנטנטים המובהקים לנפחים קטנים יותר כדי למנוע מחזורי קיפאון-הפשרה, ואז מאחסנים אותם בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס לניתוח עתידי. ניתוח היסטולוגי חשף נזק מעי גבוה משמעותית בעכברים חסרי SHIP בהשוואה לביקורת SHIP. טיפול בדקסמתאזון הפחית נזק היסטולוגי בעכברים חסרי SHIP, אף על פי שהירידה לא הייתה מובהקת סטטיסטית.

צביעת הטריכרום של מסון הראתה עלייה משמעותית בהצטברות קולגן בעכברים חסרי SHIP בהשוואה לביקורת SHIP, מה שמעיד על ציוני פיברוזיס גבוהים יותר. טיפול בדקסמתאזון הפחית משמעותית את הפיברוזיס בעכברים חסרי SHIP, והקרב את הציונים לביקורת חיובית ל-SHIP. צביעת כחול אלציאני ו-PAS אישרו היפרפלזיה של תאי הגביע בעכברים חסרי SHIP, שירדה באופן ניכר לאחר טיפול בדקסמתזון.

ריכוזי בטא של IL-1 היו גבוהים משמעותית בעכברים חסרי SHIP בהשוואה לביקורת SHIP. דקסמתזון הפחית משמעותית את ריכוזי IL-1beta בעכברים חסרי SHIP. ריכוזי MPO היו גבוהים משמעותית בעכברים חסרי SHIP בהשוואה לביקורת SHIP, והעלייה הזו הופחתה על ידי דקסמתאזון מבלי להגיע למובחנות סטטיסטית.

ריכוזי LCN-2 היו גבוהים גם בעכברים חסרי SHIP, אך ערכים גבוהים לא הוקטנו באופן עקבי על ידי דקסמתזון. ריכוזי בטא של IL-1 היו בקורלציה חיובית עם ציוני נזק היסטולוגיים וציוני פיברוזיס, מה שמעיד על קשר בין דלקת לפגיעת רקמות. ציוני נזק היסטולוגיים היו בקורלציה חיובית עם ציוני הפיברוזיס, מה שמרמז כי נזק לרקמות ולשיקום פיברוטי התקדמו במקביל.