מודל עכבר של תסחיף מיקרווסקולרי למיקרוסקופיה דו-פוטונית בחיים באמצעות מיקרוספירות פוליסטירן פלואורסצנטיות
21 בנובמבר 2025
פרוטוקול זה מכיל תיאור מקיף של גישה שלב אחר שלב למודל עכבר חלון גולגולתי כרוני ותסחיף מיקרווסקולרי מותאם להדמיה מיקרוסקופית דו-פוטונית בתוך ה-vivo באמצעות מיקרוספירות פוליסטירן פלואורסצנטיות.
באמצעות שיטת הזרקת מיקרוספירות זו, אנו שואפים לפענח את ההשלכות הקצרות והארוכות טווח של סתימת נימים כדי לחקור מנגנונים פוטנציאליים לפינוי תסחיף ברשת הנימים המוחית. הוא מאפשר הדמיה בזמן אמת ב-vivo ומעקב אחר חלקיקים פלואורסצנטיים ברשת הנימים הקורטיקלית. המיקרוספירות וההשלכות המקומיות ניתנות למעקב במשך שבועות לאחר ההזרקה.
המחקרים שלנו מסייעים להבין את הנזק המקומי לרקמות הנגרם על ידי חסימות מיקרווסקולריות. תוצאות אלו עשויות להוביל לאסטרטגיות טיפול חדשות. כעת אנו יכולים ללמוד יום אחר יום ובמשך שבועות כיצד סתימה נימית משנה כלי דם, מפעילה תאים, משנה את זרימת הדם ופוגעת במחסום הדם-מוח.
כדי להתחיל, צבוט את אצבע הרגל של עכבר מורדם כדי לבדוק את עומק ההרדמה. בצע חתך בקו אמצעי של כ-0.5 סנטימטרים מעל קנה הנשימה מתחת לסת התחתונה באמצעות מספריים כירורגיים ומלקחיים. נתח את רקמת החיבור השטחית לפאציה הצווארית באמצעות מלקחיים מיקרו-קושרים כדי לחשוף את שרירי ההיואיד הסטרנליים שמתחת.
כעת, הפרדו את שרירי ההיואיד השמאלי והימני בסטרנל על ידי קריעה עדינה של רקמת החיבור ביניהם. משוך את שריר האומוהיואיד הימני בזנב-צדדי באמצעות וו רקמה. ודאו שהמשולש הקרוטידי הימני, הכולל את העורק הקרוטידי המשותף, העורק הקרוטידי הפנימי והעורק הקרוטידי החיצוני, נראים בבירור.
לאחר מכן, הסר כל פאשיה ורקמת שומן שנותרה סביב עורק הקרוטיד המשותף. הפרדו בזהירות את עורק התרדמה הרגיל מהעצב הוואגוס. מניחים שני חוטים 4/0 1.5 סביב עורק הקרוטיד הנפוץ וקשור אותם ברפיון, כדי לוודא שהקשרים אינם מפריעים לזרימת הדם.
הסר את הפאשיה ורקמת השומן מהעורק הקרוטידי הפנימי ומהעורק הפריאטלי האחורי. לאחר מכן קשרו זמנית את העורק הפריאטלי האחורי ואת כל הענפים הצדדיים הפנימיים, כולל העורק העורפי, על ידי קשירת קשר עם חוט 4/0 1.5. הסר את הפאשיה ורקמת השומן מהעורק הקרוטיד החיצוני ומהעורק הטמפורלי.
הניחו שני קשרים רופפים סביב עורק התרדמה החיצוני והעורק הטמפורלי באמצעות הברגות בגודל 4/0 1.5. מקם את החוט הדיסטלי ביותר הרחק ככל האפשר מהפיצול בצורת Y, והשתמש בו לקשירת עורק הקרוטיד החיצוני והעורק הטמפורלי לצמיתות. תשאיר את הקשר הפרוקסימלי פתוח.
הומוגניזציה וסוניקה של מיקרוספירות 10 מיקרומטר כדי לקבל השעיה אחידה של חלקיקים בודדים. הוסף 20 מיקרוליטר של מיקרוספירות הומוגניות ל-140 מיקרוליטר של FITC-Dextran כדי לקבל נפח סופי של 160 מיקרוליטר של תערובת המכילה 1.44 כפול 10 לכוח של חמישה מיקרוספירות. למשוך בקצרה את המזרק שמחובר לקטטר כדי ליצור תא אוויר.
לאחר מכן טבלו את קצה הקטטר בתערובת המוכנה FITC-Dextran/Tween20/microsphere ומשכו לאט את המזרק לאחור עד שהתערובת נכנסת לקטטר. ודא שאין בועות אוויר בקטטר. הניחו את המזרק עם הקטטר הטעון במשאבת המזרק.
כוון את המשאבה ל-10 מיקרוליטר לדקה ופעל עד שמופיעה טיפה קטנה של תערובת מיקרוספירה בקצה הקטטר. כעת, הניחו קליפס כלי דם על עורק התרדמה הפנימי והדק אחד מהקשרים הפרוקסימליים שהוכנו מראש סביב עורק הקרוטיד המשותף. באמצעות מיקרו-מספריים, יש ליצור חתך אלכסוני קטן בעורק התרדמה החיצוני כ-0.5 מילימטרים רחוק מחוט הקשירה, כדי להבטיח שגודל החתך יהיה מעט קטן מקוטר הקטטר.
ספוג כל דם עם בד סטרילי. הפעל לזמן קצר את משאבת המזרק כדי ליצור טיפה של תערובת מיקרוספירה בקצה הקטטר, מה שמאשר שאין אוויר בקצה הקטטר. פתח את חתך עורק הקרוטיד החיצוני והכניס את הקטטר באמצעות מיקרו-מלקחיים דקים.
לאחר מכן אבטח את הקטטר בעורק הקרוטיד החיצוני על ידי הידוק התפר הפרוקסימלי סביב עורק הקרוטיד החיצוני. השאב בהדרגה במהירות של 10 מיקרוליטר לדקה עד שהעורק מתרחב לעין והצבע הירוק של FITC ממלא את עורק הקרוטיד החיצוני, מה שמאשר הצלחה בהזרקה. לאחר מכן, הסר את קליפס הכלי מהעורק התרדמי הפנימי.
לאחר מכן הגדילו את קצב זרימת משאבת המזרק ל-20 מיקרוליטר לדקה. אשר הזרקת מיקרוספירה מוצלחת על ידי אימות שהעורק התרדמי הפנימי הרחוק מהפיצול האחורי של העורק הפריאטלי מלא בצבע FITC. לאחר שהזריקה מצליחה, יש להסיר את החוט שקשר את עורק הקרוטיד המשותף, כדי לאפשר לתערובת המיקרוספירה לזרום לעורק הקרוטיד הפנימי.
במהלך ההזרקה, ניתן עדיין להבחין בצבע FITC בעורק הקרוטיד החיצוני. כבה את משאבת המזרק ברגע שהתערובת בקטטר מגיעה לסימן 80 מיקרוליטר כדי לעצור את ההזרקה. לאחר מכן קשרו את עורק הקרוטיד המשותף, גזרו את הקרוטיד הפנימי, והסירו בעדינות את הקטטר, תוך שמירה על חוט הקידוח במקומו.
לקשור לצמיתות את עורק הקרוטיד החיצוני על ידי הידוק החוט שקיבל את הקטטר. הסר את קליפס הכלי והחוטים סביב עורק התרדמה המשותף, העורק הקרוטידי הפנימי והעורק הפריאטלי האחורי כדי להחזיר את זרימת הדם. הצלחת ניתוח התסחיף המיקרווסקולרי אושרה על ידי הדמיה במקום של כל הגוף והמוח המלא, ארבעה ימים לאחר הניתוח.
פרוסת מוח סגיטלית הראתה שכון של מיקרוספירות במוח. מוחות עכברים שחולצו יום אחד לאחר הניתוח הראו כי מיקרוספירות היו תקועות בעיקר בחצי הכדור השני בצד, בתוך אזור הזרימה של העורקים המוחיים האמצעיים והקדמיים. מספר המיקרוספירות בפרוסות מוח עלה משמעותית כאשר Tween20 נוסף לתערובת המיקרוספירה.
העכברים איבדו פחות משקל והחלימו מהר יותר לאחר ניתוח כאשר הוזרק לתערובת מיקרוספירה שהכילה את Tween20. תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנציה של קליפת המוח שצולמו 0.5 שעות לאחר הניתוח הראו נקודות לבנות בודדות, המייצגות מיקרוספירות החוסמות נימים. תמונות הקרנה של שני פוטונים ב-z-stack הראו מיקרוספירות הגורמות לתסחיפים מיקרווסקולריים מוחיים עם פגיעה בפרפוזיה.
תסחיפים גם גורמים להפרעה במחסום הדם-מוח עם דליפת צבע נראית לעין מהכלי הדם.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר גישה מפורטת שלב אחר שלב ליצירת מודל עכבר עם חלון גולגולתי כרוני ותסחיף מיקרו-וסקולרי, המותאם לדימות במיקרוסקופיה דו-פוטונית in vivo. השיטה עושה שימוש במיקרו-ספירות פוליסטירן פלורסצנטיות כדי לחקור את ההשפעות של חסימת נימי דם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- מחקר מיקרו-וסקולרי
- טכניקות דימות in vivo
רקע
- הבנת ההשלכות של חסימות מיקרו-וסקולריות היא חיונית לפיתוח אסטרטגיות טיפול חדשות.
- דימות בזמן אמת מאפשר מעקב אחר חלקיקים פלואורסצנטיים ברשת הנימיים המוחית.
- מחקרים קודמים הראו שחסימת נימיים עלולה להוביל לנזק רקמתי מקומי.
- מחקר זה נועד להשקיף על המנגנונים של פינוי תסחיפים במוח.
מטרת המחקר
- לחקור את ההשפעות קצר הטווח וארוך הטווח של חסימת נימי דם.
- להבין כיצד חסימות של כלי דם זעירים משפיעות על זרימת הדם ועל מחסום הדם-מוח.
- לבחון אסטרטגיות טיפול פוטנציאליות למצבים הקשורים לנזק של כלי דם זעירים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- יצירת חלון גולגולת כרוני בעכברים לצורך דימוי.
- הזרקת מיקרוספירות פלואורסצנטיות להשראת תסמים מיקרו-וסקולריים.
- שימוש במיקרוסקופיה דו-פוטונית לדימוי בזמן אמת.
- דימוי לאחר ניתוח כדי לאשר את השקיעת המיקרוספירות במוח.
תוצאות עיקריות
- מיקרוספירות שקעו בעיקר בהמיספרה האיפסילטרלית.
- נצפתה עלייה במספר המיקרוספירות עם הוספת Tween20.
- עכברים שהוזרק להם Tween20 הראו התאוששות מהירה יותר לאחר הניתוח.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית חשפה חסימה של קפילרות על ידי המיקרוספירות.
מסקנות
- שיטה זו מאפשרת מחקר מפורט של חסימות מיקרו-וסקולריות in vivo.
- הממצאים עשויים להוביל לתובנות חדשות לגבי אסטרטגיות טיפול במצבים מיקרו-וסקולריים מוחיים.
- המחקר משפר את ההבנה של דינמיקת זרימת הדם ונזקי הרקמה במוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודלים של תסביב מיקרו-ודוליתי המשתמשים במיקרו-ספירות פלואורסצנטיות ובמיקרוסקופיה דו-פוטונית in vivo מספקים פלטפורמה חסונה לניתוח המנגנונים וההשלכות של חסימות מיקרו-ודוליתיות מוחיות. גישה זו מאפשרת מעקב לאורך זמן וברזולוציה גבוהה של אירועים ודוליתיים ותגובות רקמה, ובכך תומכת בביטחון חזוי בתיקוף של מטרות נוירו-ודוליתיות בשלבים מוקדמים. היכולת לשחזר את המודל ותוצרי הדמיה כמותיים הופכים אותו לנכס בעל ערך למיון תיקי פיתוח ולהסרת סיכונים מנגנונית בגילוי תרופות נוירו-ודוליתיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של השערות לגבי פגיעה נוירו-וסקולרית באמצעות השראה מבוקרת של מיקרו-חסימות.
- תומך בהסרת סיכונים מנגנונית על ידי ויזואליזציה של תגובות כלי דם, תאים ומחסום הדם-מוח לאורך זמן.
- מסייע בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי קישור אירועי אמבולה לנזקים לרקמות במורד הזרם ולדינמיקת פינוי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכת in vivo מתוקף להערכה כמותית של חסימה מיקרו-וסקולרית ופרפוזיה חוזרת.
- מספק פלטי דימויים בעלי תוכן גבוה וניתנים לשחזור, המתאימים לסטנדרטיזציה של בדיקות ולהשוואות בין מחקרים.
- מאפשר סריקה של התערבויות מועמדות המכוונות לפינוי תסלילים או להגנה נוירווסקולרית.
מחקר תרגומי ופקליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלה של פגיעה מיקרו-וסקולרית מוחית לצורך חקירת ביומרקרים תרגומיים.
- תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני על ידי אפשור מעקב אורך של תוצאות.
- מספק בסיס להחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות כימות תגובות רקמתיות וכלי דם לחסימות מיקרוסקופיות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
מודל זה משתלב ברצף של תהליך הגילוי ועד לשלב הפרה-קליני, ומגשר בין מחקרים מכניסטיים למחקר תרגומי בביולוגיה נוירו-וסקולרית.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערות על פגיעות מיקרו-וסקולרית ומנגנוני פינוי באמצעות דימוי בזמן אמת.
- סינון: מספקת מדדים כמותיים וניתנים לשחזור להערכת תרופות מועמדות in vivo.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה סטטיסטית של עומס התסמים, נזק רקמתי והחלמה בין קבוצות ניסוי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים מכניסטיים לנקודות סיום רלוונטיות למחלה ולפיתוח ביומרקרים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה סטנדרטית וניתנת לשימוש חוזר למחקר נוירו-וסקולרי ובדיקת התערבויות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות נוירו-וסקולריות ובצמצום סיכונים מכניסטיים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) באמצעות פרוטוקולי דימוי והזרקה סטנדרטיים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות לגבי המשכיות הפרויקט (go/no-go) על ידי אספקת נתונים כמותיים ואורכיים על תוצאות כלי דם ורקמות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם-סיכון של תוכניות נוירו-וסקולריות בהתבסס על ראיות in vivo חזקות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרו-כירורגיה, בדימיון in vivo ובניתוח כמותי של אירועים וסקולריים.
- דורש גישה למיקרוסקופיה של שני פוטונים (two-photon microscopy) ותשתית לדימיון תלת-ממדי לאחר המוות (post-mortem 3D imaging).
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של תערובות ההזרקה ושל פרוטוקולי הדימיון לצורך הדירות (reproducibility).
- ניתן להתאמה למודלי עכברים שונים, אך עשוי לדרוש אופטימיזציה עבור אזורים וסקולריים שונים.
- מגבלות פוטנציאליות כוללות מורכבות טכנית וצורך בניטור ארוך-טווח של בעלי החיים.
