בדיקת פירוק ביולוגי אירובי של חומרים באמצעות חיסון מי ים טבעי ומד נשימה בלולאה סגורה

המחקר שלנו מכמת את קצב ההתפרקות האירובית ואת דרגת החומרים הטבעיים בסביבה הימית באמצעות חיסון מי ים טבעי להשוואת נתונים. האתגרים הניסיוניים הנוכחיים שלנו כוללים קיבולת בדיקה מוגבלת וחוסר בתשתיות לענות על הביקוש הגובר לבדיקות ביודגרדקציה, תוך שמירה על שיטות אחידות ושקופות במעבדות. כדי להתחיל, אספו 10 עד 20 ליטר מי ים לתוך קרבוי של 20 ליטר עם נוזל חומצה באמצעות בקבוק גדול של ניסקין.

העבר את הקרבוי המלא חזרה למעבדה. העבר ליטר אחד של מי ים מלא מהקרבוי לבקבוק HDPE ענבר בנפח ליטר אחד עם נוזל חומצה לניתוח חלקיקי פחמן וחנקן. סינן אותו דרך ממברנת אצטט תאית של 0.2 מיקרומטר, דלת חנקן.

עכשיו, מלא בקבוקון נפחי של ליטר אחד, שניים או ארבעה ליטר עד חצי במי ים. אם מי הים מכילים חומר אורגני עתיר חלקיקים, סננו אותם דרך רשת של 20 מיקרומטר כדי להסיר חלקיקים הטרוגניים גדולים. לאחר מכן לאסוף 60 מיליליטר של סינון לבקבוק פוליאתילן שנשטף בחומצה לניתוח חנקן וזרחן אנאורגני ואורגני מומס.

כיסו ברפיון את פתח הקרבוי כדי לאפשר תנאים אירוביים. אחסן בחושך בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עד שבעה ימים. לאחר מכן, הניחו 10 עד 15 גרם מהמצע הניסיוני בצנצנת טחינה נירוסטה בנפח 50 מיליליטר.

עם כדור פלדה בקוטר 20 מ"מ. טבלו את צנצנת הטחינה בחנקן נוזלי למשך 15 דקות כדי לשבור אותה. אבטח את צנצנת הטחינה במחבר לטחנת הכדורים.

לאחר מכן כוון את המכשיר ל-30 הרץ ושתי דקות ו-30 שניות, ולחץ על התחל. בצע טחינה ארבע פעמים עם 30 שניות קירור בחנקן נוזלי בין כל מחזור. טחנו את המצע לגודל חלקיקים אחיד בין 0.10 ל-0.25 מילימטרים לפני תחילת הבדיקה.

באמצעות איזון מדויק עם רגישות של 0.001 גרם, שקלו 0.5 גרם לליטר של כלוריד אמוניום ו-0.1 גרם לליטר של פוספט אשלגן מונובסיסי. הוסיפו את החומרים המזינים הלא-אורגניים לבקבוק. תביא את הנפח לסימון עם מי ים.

אחר כך הכניסו מוט ערבוב וערבבו על צלחת ערבוב עד שכל המלחים מתמוססים. באיזון אנליטי, שקלו 20 מיליגרם של תת-הבדיקה או הביקורת. הקלט את כל משקל הקריאה והניח את הבקבוקון בצד.

כדי להקים את כלי הכור, השתמשו בפיפטה נפחית בנפח 75 מיליליטר עם בקר פיפטות ממונע ושואפים את מי הים כדי להזרים 75 מיליליטר של מי ים המושלמים בחומרים מזינים לכל כלי ריאקטור. הסר כשלושה מיליליטר של מי ים מכל כלי שיט. לאחר מכן מניחים אותו על משטח נקי ליד הכלי כדי לשטוף את המצע המעובד מהבקבוקון הקרוע.

כעת העבר את המצע המעובד לכלי הכור המתאים מהבקבוקון הקרוע. שים טבעת O על שפת כלי הכור. לאחר מכן מניחים מכסה דו-פורט מעל טבעת ה-O ומאובטחים עם מכסה בורג.

חבר כל כלי כור לקווי הגז או העיבוי התואמים שלו. הכנס היטב את קווי הגז ליציאות הכניסה והיציאה המתאימות במכסה. הפעל את פלטפורמת השייקר ל-0.05G במצב רציף.

בדוק ויזואלית שכל הכלים מאובטחים, ואז סגור את דלת האינקובטור. בתוכנת הכלי, עבר לניסוי ולחץ על הגדרה. הזן את מספרי ההתחלה והסיום של ערוץ מהתפריטים הנפתחים המתאימים לערוצים תפוסים.

הגדר את סף הרענון ל-0.50. רענון מרווח ל-NA וחלון רענון לאוטומטי. ואז סמן את התיבה של חיישני ניקוי תחת הגדרות שונות.

ודא שמדידת נפח אוטומטית, צריכת חמצן חיובית ומצב זרימה פתוחה לא נבחרו. הגדר את מרווח הדגימה ל-8.00. לאחר מכן כוון את יחידות הגז והזמן לפי הצורך.

אם משתמשים בגלאי טמפרטורה ראשוני לתיקון טמפרטורת הדגירה, ודאו שלא נבחרה טמפרטורות כניסה ידנית לתא (Manual Entemp Temps). סמן את התיבה של מצב אוורור וודא שמצב ניקוז לא נבחר. כעת, בחר ב-Chamber Setup והזן את תוויות הערוצים התיאוריות.

אם יש דליפה, יש לוודא שה-O-ring נקי, יושב וללא חלקיקים או סיבים. הדק את מכסה הברגים. בדוק את חיבורי הצינורות בכניסה וביציאה.

צינור גזום שחוק או מעוות מסיים בלהב חד ליצירת חיתוכים נקיים. מהתפריט, בחר כלים, לחץ על תפריט השירות, ואשר כי גלאי הטמפרטורה הראשי מודד 30 מעלות צלזיוס עם שתי שינויים ויציב. לחץ על רץ כדי להתחיל את הניסוי.

שמור את קובץ הניסוי תחת שם תיאורי, כולל התאריך, ורשום את שם הקובץ בגיליון הנתונים. הייצור המצטבר של פחמן דו-חמצני במשך 84 ימים אישר את הביצועים הצפויים. במהלך 84 ימים, התאית הראה ייצור מהיר של פחמן דו-חמצני לאחר השהיה קצרה, והגיע לכ-700 מיקרומולים.

PHA הראתה קצב התחלתי איטי יותר במשך שלושה ימים. ובקרת מי הים נשארה נמוכה ב-150 מיקרומולים. שכפולים שליליים בודדים בביקורת הראו שונות נמוכה, כאשר כל העקומים נשארו קרובים זה לזה.

שכפולים חיוביים לבקרת תאית הראו שונות נמוכה באופן עקבי, מה שאישר ביצועים יציבים בכל ארבעת השכפולים. במאגר הנתונים של התוצאה השלילית, השכפול החמישי הציג זינוק חריג בקצב ייצור פחמן דו-חמצני, ככל הנראה בשל חומר אורגני לא יציב, אך הייצור המצטבר שלו החל להגיע למצב של 100 מיקרומולים. שכפולים של אחד מכל שישה הציגו ייצור פחמן דו-חמצני נמוך יותר בהשוואה לאחרים, מה שמרמז על בעיות טכניות פוטנציאליות.

השגיאה הסטנדרטית של ייצור פחמן דו-חמצני ממוצע מצטבר בביקורת שלילית הייתה 2.5%, המצביעה על שונות נמוכה בין השכפולים. השגיאה הסטנדרטית בביקורת החיובית של התאית הייתה 0.83%, מה שמאשר עוד יותר שחזוריות גבוהה של מבחן הביודגרדציה. ל-PHA יש מינרליזציה גבוהה קרובה לבקרה החיובית, עם שגיאה סטנדרטית השוואה לבקרה.

פרוטוקול זה מתמודד עם הפער בשיטות הנגישות הסטנדרטיות לסינון הביודגביליות של חומרים בסביבה הימית עבור התעשייה, האקדמיה והגופים הרגולטוריים. הפרוטוקול מספק דרך מהירה וסטנדרטית למדידת ביודגרדציה ישירה זו, עם משך בדיקה קצר יותר בהערכת דגימות סימולטנית. הפרוטוקול מאפשר בדיקות סטנדרטיות עם תפוקה גבוהה להשוואה בין חומרים למעבדה בלמידת מכונה ומידול חיזוי של ביצועי חומרים.