הערכת בטיחות מיקרוביאלית של מחלבות באמצעות פרופיל פרוטאומי חיידקי באמצעות גישת MALDI

פיתחנו פרוטוקול להכנת ובידוד קהילות מיקרוביאליות ממוצרים יומיומיים שונים, כגון חלב, שמנת, חמאה וגבינה. לאחר הבידוד, ניתן לזהות את המיקרואורגניזם במהירות ובדיוק באמצעות MALDI-TOF MS. אופטימיזציה של תנאי התרבית נותרה אתגר מרכזי, לצד פערים במאגרי נתונים והקצבת חיידקים גרם-חיוביים ומייצרי נבגים. כדי להתחיל, קבל דגימה מייצגת של מוצרי החלב וערבב היטב כדי להבטיח אחידות.

באופן אספטי, העבר מיליליטר אחד או גרם אחד של דגימות מוצקות לצינור צנטריפוגה קוני בגודל 15 מיליליטר המכיל תשעה מיליליטרים של מדיום נוזלי סטרילי. סחרור את הצינור בעוצמה במשך 30 עד 60 שניות כדי להומוגן את הדגימה. לאחר מכן, יש להכין סדרה של דילול פי עשרה על ידי העברת מיליליטר אחד מהמתלה ההומוגני לצינורות עוקבים, שכל אחד מהם מכיל תשעה מיליליטרים של תמיסה סטרילית.

ערבבו כל דילול היטב על ידי מערבולת או ניעור. לאחר מכן, קחו 0.1 מיליליטר מהדגימה המקורית, או אחת מהדילול המוכן, והעבירו על פני השטח של צלחת פטרי מוכנה המכילה את מדיום האגר המתאים. באמצעות מפזר סטרילי, פזר את החיסון באופן שווה על פני לוח האגר.

לדגירה אירובית, חסן את פלטות האגר של APT, M17, CBL, MPCA ו-TSA עם הדגימות המוכנות. דגרו את הלוחות בתנאים אירוביים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-30 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לדגירה אנאירובית, יש להניח את לוחות האגר של MRS המחוסנים בתא אנאירובי ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-30 מעלות צלזיוס למשך 24 עד 72 שעות.

הסר את הלוחות מהאינקובטור ובדקו אותן מדי יום כדי לעקוב אחר התפתחות מיקרוביאלית. באמצעות לולאה מיקרוביאלית של מיקרוליטר אחד, פסים את המושבות הנבחרות על אותו מדיום אגר כדי לתת-תרבת. הדגירה באותם תנאים שהיו בשימוש קודם.

לניתוח ספקטרומטריית מסה, יש להתחיל בהכנת פתרון מטריצת MALDI. הכינו את תערובת הממס עם 50% אצטוניטריל, 47.5% מים בדרגת HPLC, ו-2.5% חומצה טריכלורואצטית. המיס את תרכובת המטריצה לתערובת הממס לריכוז סופי של כ-10 מיליגרם למיליליטר.

לזיהוי חיידקים בטרשת נפוצה באמצעות שיטת ההעברה הישירה של מושבה, יש להשתמש בלולאה סטרילית להעברת מיקרוליטר אחד של מושבת חיידקים שגדלה לנקודה על פלטת היעד של MALDI. פזר את החומר החיידקי ליצירת שכבה דקה ואחידה על הלוח. לאחר הייבוש, הוסיפו מיקרוליטר אחד של תמיסת מטריצת HCCA מעל ותנו לה להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר.

בשיטת חילוץ חומצה פורמית מדויקת, השתמש בלולאה מיקרוביאלית חד-פעמית או קיסם שיניים סטרילי כדי לאסוף כמות קטנה של ביומסה חיידקית ממושבה אחת. מרחו את החומר ישירות על נקודה בלוח היעד של MALDI ליצירת שכבה דקה ואחידה. הוסיפו מיקרוליטר אחד של תמיסת חומצה פורמית 70% מעל האזור המרוח.

לאחר שהכתם התייבש, שכבו אותו במיקרוליטר אחד של תמיסת מטריצת HCCA ותנו לו להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר. בשיטת חילוץ חלבון בתוך הצינור, יש להעביר מושבה אחת עד שלוש מושבות שלמות מלוח תרבית אגר לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר המכיל 300 מיקרוליטר מים סטריליים. הוסף 900 מיקרוליטר של אתנול מוחלט כדי להגיע לריכוז אתנול סופי של כ-75%. לאחר ערבוב קצר של התכולה, צנטריפוגה את הצינור למשך שתי דקות ב-15,000 גרם בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, זרקו בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור התא. לאחר מכן, הוסף 20 עד 50 מיקרוליטר של חומצה פורמית 70% לכדור התאים היבש. ערבבו את התכולה על ידי פיפטינג או מערבולת עד שהכדור תלוי לחלוטין.

עכשיו, הוסיפו נפח שווה של אצטוניטריל לתליית חומצת הפורמית וערבבו היטב. צנטריפוגה את הצינור ב-15,000 גרם למשך שתי דקות. העבר מיקרוליטר אחד מהסופרנטנט המתקבל לנקודה מסוימת על לוח מטרה של MALDI ומאפשר לו להתייבש.

לאחר מכן, הניחו את הנקודה היבשה במיקרוליטר אחד של תמיסת מטריצת HCCA. פיפט מיקרוליטר אחד של תקן בדיקת חיידקים המכיל תמצית של Escherichia coli DH5 alpha או מכייל מיקרוביולוגיה המכיל תמצית חלבון E.coli ATCC 25922, ריבונוקלאז ומיוגלובין. לרכישת ספקטרום וזיהוי מיקרוביאלי, יש להכין נקודות כיול על לוח המטרה של MALDI.

טען את לוח המטרה של MALDI עם נקודות הדגימה המוכנות ונקודות הכיול למכשיר ספקטרומטריית המסה. הרץ את ניתוח הכיול במצב כיול כדי לכייל את המערכת. הפעלת ספקטרומטר המסה במצב יוני חיובי ליניארי לרכישת ספקטרום כללי.

לאחר מכן, הגדר את טווח גילוי המסה של ספקטרומטר המסה כך שיכסה בין 2,000 ל-20,000 יחס מסה-מטען. רכש ספקטרום כפול לכל נקודה כדי לייצר לפחות ארבעה שכפולים טכניים לכל דגימה. כעת, השתמש בשיטת סביצקי-גולאי כאלגוריתם החלקה.

השתמש באלגוריתם TopHat לתיקון קו בסיס כדי להסיר רעש רקע. לאחר מכן, מזהה פיקים באמצעות מצב צנטרואיד. העלה את ספקטרום המסה המעובד של מבודדי חיידקים לא ידועים לפלטפורמת זיהוי המיקרובים בתוך תוכנת MALDI והריץ את הזיהוי.

הערך את ציוני הזיהוי בהתאם לסטנדרטים של היצרן. ספקטרומטריית המסה הציגו פרופילי חלבונים ייחודיים למין, מה שאפשר זיהוי ברמת הסוג או המין. הדנדרוגרם גילה דמיון גבוה שנצפה בין זנים מאותו מין והבחנה ברורה בין מינים.

זמן דגירה קצר יותר של 12 שעות עבור Bacillus licheniformis הניב ציון זיהוי גבוה יותר של 2.38, בעוד דגירה ארוכה יותר של 18 עד 24 שעות הובילה לציון זיהוי נמוך יותר של 1.85 בשל דומיננטיות אותות הנבגים. מבין שיטות הכנת הדגימה, חילוץ חלבון בתוך הצינור נתן את ציון הזיהוי הגבוה ביותר של 2.23, אחריו הפקת חומצה פורמית מדויקת עם 1.97, והעברת מושבה ישירה, שהובילה לציון הנמוך ביותר של 1.61. על ידי שילוב קולטורומיקה עם הכנת דגימות מותאמת אישית, MALDI מאפשר ניתוח מיקרוביום מדויק ומהיר יותר בעלות נמוכה יותר, ומפיק תוצאות השוות לשיטות rRNA של 16S ייחוס.

פרוטוקול זה מאפשר ניטור שגרתי ומהיר של מיקרואורגניזמים במוצרי חלב, המשפר את מהירות ודיוק הגילוי ובסופו של דבר מחזק את מערכות איכות ובטיחות המזון. הרחבת מסדי הנתונים של MALDI ואוטומציה של תהליכי עבודה במעבדות תעשייתיות תשפר את זיהוי המיקרוביה, תגדיל את קצב התפוקה, תפחית שגיאות ותאיץ את ניטור המיקרוביוטה.