Name: אקטין Co-Assay שקיעה, כי ניתוח של חלבון מחייב את ה-F-אקטין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-28T01:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: למד את שיטת actin co-sedimentation לניתוח אינטראקציות חלבון-F-actin בתא. שיטה זו מאפשרת למדוד ספציפיות קישור ולהבין מנגנוני שלד תאי דינמיים במחקר ביולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

תודה ד&quot;ר פדרו קומאר במעבדה ויטמן באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו לסרט של אקטין בתאים HaCAT.

1. הכנת אקטין מקור אקטין בשימוש assay זה היה בלתי אנושי שריר טסיות (β-אקטין) המתקבל cytoskeleton aliquots בע&quot;מ במלאי ב 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​נשמרים במקפיא -70 מעלות צלזיוס. עבור assay, אקטין הוא מדולל ל 0.4 מ&quot;ג / מ&quot;ל במאגר המכיל 5 מ&quot;מ טריס pH 8, 0.2 מ&quot;מ CaCl 2, 0.2 ו - 0.5 mM ATP DTT מ&quot;מ, centrifuged ב g 20,000 עבור 10 דקות ב 4 º C. Supernatant, אשר אקטין monomeric הוא מוכן להיות polymerized. פילמור אקטין הוא המושרה על ידי 50 בנוסף KCl mM, 1 mM ATP ו - 2 מ&quot;מ MgCl 2. פילמור מתרחש בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. 2. הכנה של חלבון ב assay זה, אנו משתמשים C-הסופית של תלין, אשר כבר מטוהרים כמו חלבון GST-תייג. חלבון לשמש assay נתונה צנטריפוגה מהיר מראש ברור של אגרגטים לפני הדגירה עם אקטין-F. חלבון הוא הסתובב בבית גרם 100,000 ב ultracentrifuge Beckman במשך 20 דקות ב 22 º C. 3. החלבון אקטין דגירה כמות החלבון אקטין assay ישתנו. בדוגמה זו אנו משתמשים אקטין עודף. בדרך כלל, יחס טוחנת מחושבת, למשל. יחס של 4:01 טוחנת אקטין לחלבון. ב assay הבאה, היקף התגובה הסופית היא 150 μl. חיץ שבו חלבון ו-F-אקטין מודגרת יהיה תלוי החלבון להיבדק על התנאים הנדרשים. בדוגמה זו, אנו משתמשים למאגר המכיל 10 mM טריס pH 7.0, 1 mM ATP, 0.2 מ&quot;מ DTT, 1 mM EGTA, 0.1 mM CaCl 2 ו - 2 מ&quot;מ MgCl 2. חלבון ו-F-אקטין מודגרת במאגר שעה 1 בטמפרטורת החדר. 4. שקיעה של ה-F-אקטין לאחר דגירה, הדגימות הם הסתחררו ב 100.000 גרם ב 22 º C. אנו משתמשים ultracentrifuge Beckman בסרטון. הרוטור הוא הסיר בזהירות כדי לא להפריע את כדורי. 5. ניתוח של חלבון שיתוף שקיעה עם ה-F-אקטין Supernatants יוסרו בקפידה על ידי pipetting לתוך צינור Eppendorf ו 5 X Laemmli SDS-PAGE חיץ המדגם הוא הוסיף. נפח מתאים של 1 חיץ X SDS-PAGE מדגם Laemmli הוא הוסיף את כדורי הנותרים, pipetted למעלה ולמטה, והועבר צינורות חדשים Eppendorf. הסכומים היחסית של החלבון את כדורי ואת supernatants מנותחים לאחר הפרידה שלהם על ידי SDS-PAGE ו Coomassie מכתים כחול של ג&#39;ל או המערבי סופג. על מנת לקבוע את הספציפיות של אינטראקציה עם החלבון אקטין, אקטין ריכוז תלויי שיתוף sedimentations יכול להתבצע. עבור סוג זה של הניסוי, סכום קבוע של החלבון וכן סדרה של כמויות גדלות והולכות של אקטין מודגרת, והניתוח מתבצע כמתואר לעיל.

<ol><li>Senetar, M. A., Foster, S. J., McCann, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrasteric+inhibition+mediates+the+interaction+of+the+I%2FLWEQ+module+proteins+Talin1%2C+Talin2%2C+Hip1%2C+and+Hip12+with+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Intrasteric inhibition mediates the interaction of the I/LWEQ module proteins Talin1, Talin2, Hip1, and Hip12 with actin.</a> Biochemistry. 14, 15418-15428 (2004).</li>
<li>Goldmann, W. H., Hess, D., Isenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+intact+talin+and+talin+tail+fragment+on+actin+filament+dynamics+and+structure+depends+on+pH+and+ionic+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The effect of intact talin and talin tail fragment on actin filament dynamics and structure depends on pH and ionic strength.</a> Eur J Biochem. 260, 439-445 (1999).</li>
<li>Lee, H., Bellin, R. M., Walker, D. L., Patel, B., Powers, P., Liu, H., Garcia-Alvarez, B., de Pereda, J., Liddington, R. C., Volkmann, N., Hanein, D., Critchley, D. R., Robson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+Actin-binding+Site+within+the+Talin+FERM+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of an Actin-binding Site within the Talin FERM Domain.</a> J Mol Biol. 22, 771-784 (2004).</li>
</ol>

אקטין שיתוף שקיעה היא פשוטה assay במבחנה לנתח חלבונים specfic מחייב אקטין-F. בסרטון הזה, אנחנו מראים דוגמה אחת לאופן שבו אקטין פשוט שיתוף שקיעה יכול להתבצע. אנחנו מראים איך להכין את ה-F-אקטין, להכין את חלבון להיבדק לבין הליך של אקטין שיתוף שקיעה. מספר נקודות צריך להיחשב בעת ביצוע אקטין שיתוף שקיעה מבחני. למשל, מרכיבי חיץ עבור הדגירה יכול להשתנות בהתאם החלבון להיבדק, pH טמפרטורה ריכוז מלח עלול להשפיע על כבילת אקטין-F. אנחנו הוכיחו מחייב פשוטה F-אקטין, אבל זה סוג של assay ניתן פירט על ומשמש כדי לקבוע סג...

אקטין co-assay שקיעה, כי ניתוח של חלבון מחייב את ה-f-אקטין

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Cytoskeleton אקטין בתוך התא היא רשת של סיבי אקטין המאפשר תנועה של תאים תהליכים תאיים, וזה יוצר מתח ומסייעת שומרת צורה הסלולר. למרות cytoskeleton אקטין הוא מבנה נוקשה, היא מבנה דינמי כי היא כל הזמן שיפוץ. מספר חלבונים יכולים להיקשר cytoskeleton אקטין. הכריכה של חלבון מסוים ל-F-אקטין הוא הרצוי לעתים קרובות כדי לתמוך תצפיות תא ביולוגי או יותר להבין תהליכים דינמיים עקב שיפוץ cytoskeleton אקטין. Assay שיתוף שקיעה אקטין הוא ב assay חוץ גופית בשימוש שגרתי לנתח את הכריכה של חלבונים ספציפיים או תחומים עם החלבון אקטין-F. העקרונות הבסיסיים של assay לערב דגירה של החלבון של עניין (אורך תחום מלא או של) עם ה-F-אקטין, צעד ultracentrifugation ל-F אקטין גלולה וניתוח של החלבון שיתוף sedimenting עם אקטין-F. אקטין שיתוף שקיעה מבחני יכול להיות מתוכנן בהתאם למדידת זיקות אקטין מחייב מבחני התחרות.

חלבונים הנקשרים אקטין פילמנטיות (F-אקטין) באמצעות מודולים שונים אקטין מחייב. בסרטון הזה אנחנו מדגימים את ההליך של אקטין שיתוף שקיעה, אשר מהווה ב assay חוץ גופית בשימוש שגרתי לנתח חלבונים או תחומים ספציפיים הנקשרים F-אקטין.

אקטין Co-Assay שקיעה, כי ניתוח של חלבון מחייב את ה-F-אקטין

שלד האקטין בתוך התא הוא רשת של סיבי אקטין המאפשרת תנועת תאים ותהליכים תאיים, ומייצרת...

בתא. שלד האקטין (Actin Cytoskeleton) הוא מבנה דינמי, והעיצוב מחדש שלו חשוב במגוון תהליכים, החל מחלוקת תאים, נדידת תאים ועד להובלה פיזית. מגוון רחב של חלבונים יכולים להיקשר לשלד האקטין באמצעות מודולים נפרדים של קישור לאקטין.בסרטון זה, נדגים את ההליך של שקיעה משותפת של אקטין (actin co sedimentation), שהיא בדיקת in vitro המשמשת באופן שגרתי לניתוח חלבונים או דומיינים ספציפיים של חלבונים הנקשרים לאקטין סיבי (filamentous actin). שלום, אני ג'ודי ואר מהמעבדה של ד"ר דיין ברבר במחלקה לביולוגיה של תא ורקמה ב-UCSF. בסרטון זה, אראה לכם את ההליך לביצוע בדיקת שקיעה משותפת של אקטין.פרוצדורה זו היא שיטה אחת לניתוח חלבונים הנקשרים באופן ספציפי לאקטין פילמנטרי, וניתן להשתמש בה למדידת זיקות קישור. פרוצדורה זו כוללת את השלבים הבאים: הכנת סיבי אקטין והכנת החלבון לבדיקה. דגירה של חלבון העניין עם אקטין פילמנטרי (או בקיצור f actin), השקעה של F actin באמצעות אולטרסנטריפוגציה ב-100,000 ×g, וביצוע SDS page וצביעת כוכינאיל כדי להדמות את פראקציית העלייה (supinate) ופראקציית המשקע (pellet).ולסיום, ניתוח של החלבון השוקע יחד עם f actin בפרקציית המשקע. אם כן, בואו נתחיל. כדי להכין סיבי actin, מומלץ לוודא שה-actin שבו אנו עובדים נמצא בצורה מונומרית.תמיסת סטוק של actin בריכוז 10 M per mil נשלפת מהמקפיא בטמפרטורה של 8

actin-co-sedimentation-assay-for-analysis-protein-binding-to-f

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מיישמים ללא תווית חלבון אינטראקציה באמצעות ניתוח X100 Biacore לניתוח המבנה והתפקוד של הכריכה של מוטציות ב 'מספר cystatin כדי papain דרך אפיון קינטי. כיול ללא ניתוח ריכוז (CFCA) מודד את הריכוז של חלבון עם פעילות מחייב שמר ללא צורך עקומת סטנדרט. אנו מראים כי אישור של ריכוזי באמצעות CFCA מגבירה את האמינות של הניתוח הקינטית כי קבועים הקינטית יכול להיקבע בצורה אמינה, גם אם את פעילותו של חלבון רקומביננטי מצטמצם.

חשיבותה של ריכוז חלבון נכון עבור קינטיקס וקביעת זיקה בניתוח מבנה פונקציה

פילמור של FtsZ חיוני לחלוקת תאי חיידקים. בדוח זה, אנו מפרטים פרוטוקולים פשוטים לניטור פעילות פילמור FtsZ ודנים בהשפעת הרכב המאגר. ניתן להשתמש בפרוטוקולים כדי לחקור את האינטראקציה של FtsZ עם חלבונים רגולטוריים או תרופות אנטיבקטריאליות המשפיעות על פילמור FtsZ.

FtsZ פלמור מבחני: פרוטוקולים ושיקולים פשוטים

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבחון את היכולת של חלבון לשיתוף משקעים עם אקטין filamentous (F- אקטין), ואם מחייב הוא ציין, כדי למדוד את הזיקה של האינטראקציה.

מדידת חלבון מחייב F- אקטין על ידי שיתוף שקיעה

פונקציות אנדוזום מוקדם תלויים פלמור אקטין-F. כאן, אנו מתארים מבוסס מיקרוסקופיה במבחנה assay זה reconstitutes את התגרענות ואת פלמור של F-אקטין על ממברנות endosomal מוקדם במבחנות, ובכך הפך את סדרת תגובות מורכבת זו נוטה הביוכימי ותעשיה מניפולציות.

במבחנה פלמור של F-אקטין-Endosomes מוקדם

אנו מדווחים על בדיקה פשוטה, יעילה בזמן וספקטרוסקופיה מבוססת תפוקה גבוהה לכימות סיבי אקטין בדגימות ביולוגיות אקס ויוו מרקמות המוח של מכרסמים ונבדקים אנושיים.

בדיקה מבוססת ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית חסכונית בזמן להערכת מצב פולמור Actin במכרסמים ורקמות מוח אנושיות

כדי להתקדם, קונוסים צמיחה חייבים להפעיל כוחות משיכה נגד הסביבה החיצונית. דור כוחות המתיחה תלוי בדינמיקת אקטין ובצימוד מצמד. המחקר הנוכחי מתאר שיטות לניתוח דינמיקת אקטין, צימוד מצמד וכוחות משיכה להתקדמות חרוט הצמיחה.

ניתוחים של אקטין דינמיקה, מצמד צימוד וכוח המתיחה לקידום קונוס צמיחה

אנו מציגים פרוטוקולים לבדיקות מיקרופלואידיות פשוטות של נימת אקטין, בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המאפשרות לנטר במדויק חוטי אקטין בודדים בזמן אמת תוך חשיפתם ברצף לתמיסות חלבון שונות.

שימוש במיקרופלואידיקה ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לחקור את דינמיקת ההרכבה של חוטי אקטין בודדים וחבילות

פרוטוקול זה מתאר את היווצרותם של דו-שכבתיות שומנים נתמכות ואת התוספת של חוטים ציטוסקטליים וחלבונים מוטוריים כדי לחקור את הדינמיקה של רשתות ציטוסקטליות משוחזרות, הקשורות לממברנה, באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

שחזור של קליפות אקטין מינימליות הקשורות לממברנה על דו-שכבתיות שומנים נתמכות

פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר כוכבי שביט אקטין על פני השטח של חרוזים תוך שימוש ברכיבי חלבון זמינים מסחרית. מערכות כאלה מחקות את המבנים הבולטים הנמצאים בתאים, וניתן להשתמש בהן כדי לבחון מנגנונים פיזיולוגיים של ייצור כוח בצורה פשוטה.

שחזור של תנועתיות מבוססת אקטין עם חלבונים זמינים מסחרית

שיטה זו מתארת בדיקת שיקוע חוץ גופית מבוססת לקטין כדי לכמת את זיקת הקישור של פוספטאז גלוקן ועמילופקטין. בדיקת שקיעה משותפת זו אמינה למדידת קשירת מצע גלוקן פוספטאז וניתן ליישם אותה על מצעים גלוקניים מסיסים שונים.

Concanavalin A מבוסס Sedimentation Assay למדידת קשירת המצע של פוספטאז גלוקני

למד את שיטת actin co-sedimentation לניתוח אינטראקציות חלבון-F-actin בתא. שיטה זו מאפשרת למדוד ספציפיות קישור ולהבין מנגנוני שלד תאי דינמיים במחקר ביולוגי.

אקטין Co-Assay שקיעה, כי ניתוח של חלבון מחייב את ה-F-אקטין

גלה סרטונים נוספים