Name: אקטין Co-Assay שקיעה, כי ניתוח של חלבון מחייב את ה-F-אקטין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-28T01:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: למד את שיטת actin co-sedimentation לניתוח אינטראקציות חלבון-F-actin בתא. שיטה זו מאפשרת למדוד ספציפיות קישור ולהבין מנגנוני שלד תאי דינמיים במחקר ביולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תודה ד&quot;ר פדרו קומאר במעבדה ויטמן באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו לסרט של אקטין בתאים HaCAT.

1. הכנת אקטין מקור אקטין בשימוש assay זה היה בלתי אנושי שריר טסיות (β-אקטין) המתקבל cytoskeleton aliquots בע&quot;מ במלאי ב 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​נשמרים במקפיא -70 מעלות צלזיוס. עבור assay, אקטין הוא מדולל ל 0.4 מ&quot;ג / מ&quot;ל במאגר המכיל 5 מ&quot;מ טריס pH 8, 0.2 מ&quot;מ CaCl 2, 0.2 ו - 0.5 mM ATP DTT מ&quot;מ, centrifuged ב g 20,000 עבור 10 דקות ב 4 º C. Supernatant, אשר אקטין monomeric הוא מוכן להיות polymerized. פילמור אקטין הוא המושרה על ידי 50 בנוסף KCl mM, 1 mM ATP ו - 2 מ&quot;מ MgCl 2. פילמור מתרחש בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. 2. הכנה של חלבון ב assay זה, אנו משתמשים C-הסופית של תלין, אשר כבר מטוהרים כמו חלבון GST-תייג. חלבון לשמש assay נתונה צנטריפוגה מהיר מראש ברור של אגרגטים לפני הדגירה עם אקטין-F. חלבון הוא הסתובב בבית גרם 100,000 ב ultracentrifuge Beckman במשך 20 דקות ב 22 º C. 3. החלבון אקטין דגירה כמות החלבון אקטין assay ישתנו. בדוגמה זו אנו משתמשים אקטין עודף. בדרך כלל, יחס טוחנת מחושבת, למשל. יחס של 4:01 טוחנת אקטין לחלבון. ב assay הבאה, היקף התגובה הסופית היא 150 μl. חיץ שבו חלבון ו-F-אקטין מודגרת יהיה תלוי החלבון להיבדק על התנאים הנדרשים. בדוגמה זו, אנו משתמשים למאגר המכיל 10 mM טריס pH 7.0, 1 mM ATP, 0.2 מ&quot;מ DTT, 1 mM EGTA, 0.1 mM CaCl 2 ו - 2 מ&quot;מ MgCl 2. חלבון ו-F-אקטין מודגרת במאגר שעה 1 בטמפרטורת החדר. 4. שקיעה של ה-F-אקטין לאחר דגירה, הדגימות הם הסתחררו ב 100.000 גרם ב 22 º C. אנו משתמשים ultracentrifuge Beckman בסרטון. הרוטור הוא הסיר בזהירות כדי לא להפריע את כדורי. 5. ניתוח של חלבון שיתוף שקיעה עם ה-F-אקטין Supernatants יוסרו בקפידה על ידי pipetting לתוך צינור Eppendorf ו 5 X Laemmli SDS-PAGE חיץ המדגם הוא הוסיף. נפח מתאים של 1 חיץ X SDS-PAGE מדגם Laemmli הוא הוסיף את כדורי הנותרים, pipetted למעלה ולמטה, והועבר צינורות חדשים Eppendorf. הסכומים היחסית של החלבון את כדורי ואת supernatants מנותחים לאחר הפרידה שלהם על ידי SDS-PAGE ו Coomassie מכתים כחול של ג&#39;ל או המערבי סופג. על מנת לקבוע את הספציפיות של אינטראקציה עם החלבון אקטין, אקטין ריכוז תלויי שיתוף sedimentations יכול להתבצע. עבור סוג זה של הניסוי, סכום קבוע של החלבון וכן סדרה של כמויות גדלות והולכות של אקטין מודגרת, והניתוח מתבצע כמתואר לעיל.

<ol><li>Senetar, M. A., Foster, S. J., McCann, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrasteric+inhibition+mediates+the+interaction+of+the+I%2FLWEQ+module+proteins+Talin1%2C+Talin2%2C+Hip1%2C+and+Hip12+with+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Intrasteric inhibition mediates the interaction of the I/LWEQ module proteins Talin1, Talin2, Hip1, and Hip12 with actin.</a> Biochemistry. 14, 15418-15428 (2004).</li>
<li>Goldmann, W. H., Hess, D., Isenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+intact+talin+and+talin+tail+fragment+on+actin+filament+dynamics+and+structure+depends+on+pH+and+ionic+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The effect of intact talin and talin tail fragment on actin filament dynamics and structure depends on pH and ionic strength.</a> Eur J Biochem. 260, 439-445 (1999).</li>
<li>Lee, H., Bellin, R. M., Walker, D. L., Patel, B., Powers, P., Liu, H., Garcia-Alvarez, B., de Pereda, J., Liddington, R. C., Volkmann, N., Hanein, D., Critchley, D. R., Robson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+Actin-binding+Site+within+the+Talin+FERM+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of an Actin-binding Site within the Talin FERM Domain.</a> J Mol Biol. 22, 771-784 (2004).</li>
</ol>

אקטין שיתוף שקיעה היא פשוטה assay במבחנה לנתח חלבונים specfic מחייב אקטין-F. בסרטון הזה, אנחנו מראים דוגמה אחת לאופן שבו אקטין פשוט שיתוף שקיעה יכול להתבצע. אנחנו מראים איך להכין את ה-F-אקטין, להכין את חלבון להיבדק לבין הליך של אקטין שיתוף שקיעה. מספר נקודות צריך להיחשב בעת ביצוע אקטין שיתוף שקיעה מבחני. למשל, מרכיבי חיץ עבור הדגירה יכול להשתנות בהתאם החלבון להיבדק, pH טמפרטורה ריכוז מלח עלול להשפיע על כבילת אקטין-F. אנחנו הוכיחו מחייב פשוטה F-אקטין, אבל זה סוג של assay ניתן פירט על ומשמש כדי לקבוע סג...

אקטין co-assay שקיעה, כי ניתוח של חלבון מחייב את ה-f-אקטין

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Cytoskeleton אקטין בתוך התא היא רשת של סיבי אקטין המאפשר תנועה של תאים תהליכים תאיים, וזה יוצר מתח ומסייעת שומרת צורה הסלולר. למרות cytoskeleton אקטין הוא מבנה נוקשה, היא מבנה דינמי כי היא כל הזמן שיפוץ. מספר חלבונים יכולים להיקשר cytoskeleton אקטין. הכריכה של חלבון מסוים ל-F-אקטין הוא הרצוי לעתים קרובות כדי לתמוך תצפיות תא ביולוגי או יותר להבין תהליכים דינמיים עקב שיפוץ cytoskeleton אקטין. Assay שיתוף שקיעה אקטין הוא ב assay חוץ גופית בשימוש שגרתי לנתח את הכריכה של חלבונים ספציפיים או תחומים עם החלבון אקטין-F. העקרונות הבסיסיים של assay לערב דגירה של החלבון של עניין (אורך תחום מלא או של) עם ה-F-אקטין, צעד ultracentrifugation ל-F אקטין גלולה וניתוח של החלבון שיתוף sedimenting עם אקטין-F. אקטין שיתוף שקיעה מבחני יכול להיות מתוכנן בהתאם למדידת זיקות אקטין מחייב מבחני התחרות.

חלבונים הנקשרים אקטין פילמנטיות (F-אקטין) באמצעות מודולים שונים אקטין מחייב. בסרטון הזה אנחנו מדגימים את ההליך של אקטין שיתוף שקיעה, אשר מהווה ב assay חוץ גופית בשימוש שגרתי לנתח חלבונים או תחומים ספציפיים הנקשרים F-אקטין.

אקטין Co-Assay שקיעה, כי ניתוח של חלבון מחייב את ה-F-אקטין

שלד האקטין בתוך התא הוא רשת של סיבי אקטין המאפשרת תנועת תאים ותהליכים תאיים, ומייצרת...

בתא. שלד האקטין (Actin Cytoskeleton) הוא מבנה דינמי, והעיצוב מחדש שלו חשוב במגוון תהליכים, החל מחלוקת תאים, נדידת תאים ועד להובלה פיזית. מגוון רחב של חלבונים יכולים להיקשר לשלד האקטין באמצעות מודולים נפרדים של קישור לאקטין.בסרטון זה, נדגים את ההליך של שקיעה משותפת של אקטין (actin co sedimentation), שהיא בדיקת in vitro המשמשת באופן שגרתי לניתוח חלבונים או דומיינים ספציפיים של חלבונים הנקשרים לאקטין סיבי (filamentous actin). שלום, אני ג'ודי ואר מהמעבדה של ד"ר דיין ברבר במחלקה לביולוגיה של תא ורקמה ב-UCSF. בסרטון זה, אראה לכם את ההליך לביצוע בדיקת שקיעה משותפת של אקטין.פרוצדורה זו היא שיטה אחת לניתוח חלבונים הנקשרים באופן ספציפי לאקטין פילמנטרי, וניתן להשתמש בה למדידת זיקות קישור. פרוצדורה זו כוללת את השלבים הבאים: הכנת סיבי אקטין והכנת החלבון לבדיקה. דגירה של חלבון העניין עם אקטין פילמנטרי (או בקיצור f actin), השקעה של F actin באמצעות אולטרסנטריפוגציה ב-100,000 ×g, וביצוע SDS page וצביעת כוכינאיל כדי להדמות את פראקציית העלייה (supinate) ופראקציית המשקע (pellet).ולסיום, ניתוח של החלבון השוקע יחד עם f actin בפרקציית המשקע. אם כן, בואו נתחיל. כדי להכין סיבי actin, מומלץ לוודא שה-actin שבו אנו עובדים נמצא בצורה מונומרית.תמיסת סטוק של actin בריכוז 10 M per mil נשלפת מהמקפיא בטמפרטורה של 80- מעלות, ומוכנה דילול עבודה של 2.4 mgs per mil בבופר המכיל tris, calcium chloride, ATP לייצוב המוןומר ו-DTT. דילול העבודה מוצב על קרח למשך שעה אחת. לאחר שעה של אינקובציה על קרח, תמיסת ה-actin סנטריפוגית במהירות של 14,000 RPM למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות.הנוזל העליון שיתקבל יהיה אקטין מונומרי. כעת, ממונומרי אקטין מנוקים אלו, ניתן להפיק אקטין פילמנטרי על ידי הוספה של potassium chloride, magnesium chloride, ו-TP למשך שעה אחת. בטמפרטורת החדר, האקטין הפילמנטרי מוכן כעת לדגירה עם החלבון או עם הדומיין החלבוני הרלוונטי, כפי שנראה בשלב הבא.כדי להמשיך בבדיקת שקיעה משותפת (co-sedimentation) של actin, עלינו להכין את החלבון לבדיקה. כיום אני משתמש ב-clan, שטוהר כחלבון היתוך GST. החלבון עבר ניקוי מוקדם מאגרגטים באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה, והעלייה (supernatant) שהתקבלה מוכנה כעת לשימוש בבדיקה.על מנת לבחון קישור של חלבון לאקטין, יש להשתמש בעודף של אקטין. במקרה זה, מדגריים 10 µg של אקטין יחד עם 5 µg של חלבון בבופר המכיל Tris, ATP, β-mercaptoethanol ו-EDTA ו-calcium chloride, כדי להגיע לנפח סופי של 150 µL עבור דגירת החלבון והאקטין. הדגירות מבוצעות ישירות במבחנות אולטרה-צנטריפוגה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. מבחנות אחת ושתיים משמשות כביקורות; מבחנה אחת מכילה אקטין בלבד בבופר.מבחנה שתיים מכילה חלבון בלבד בבופר. מבחנה שלוש מכילה הן את ה-actin והן את ה-CNU של talin בבופר. מבחנה ארבע מהווה בקרת נוספת לקשירה לא ספציפית, ומכילה actin וחלבון GST בלבד. לאחר דגירה של שעה אחת, הדגימות מונחות בזהירות בתוך הרוטור של Beckman.לאחר מכן, הגדרנו את האולטרה-צנטריפוגה ל-100,000 ×g והרצנו את הדגימות למשך 20 דקות ב-22 °C. לאחר סבב זה, יכולנו להכין את הדגימות להרצה ב-SDS page. עם סיום הסבב של 20 הדקות, הדגימות מוצאות בזהירות מהרוטור כדי שהמשקע לא יופרע. סימון נעשה על דופן המבחנה במיקום שבו נמצא המשקע.יש להעביר בזהירות את הנוזל העליון למבנות אפנדורף אליהן הוספו 5 µL של בופר דגימה XSCS. יש להוסיף 1 µL של בופר דגימה XSCS למשקע שנותר במבנאות העל-צנטריפוגה. לאחר פיפוטים חוזרים (petting up and down), יש להעביר את המשקע התלוי המושעה למבנאת אפנדורף נקייה.לאחר מכן מרתיחים את הדגימות בבלוק חימום למשך עד 10 דקות. לאחר ההרתחה, טוענים את הדגימות לג'ל SDS-PAGE. במקרה זה, אני משתמש בג'ל 10% שהוכן מראש.את הדגימות טוענים בזהירות לבארות בסדר הנכון. את הג'ל מריצים במתח קבוע למשך כשעה בטמפרטורת החדר. לאחר סיום ההרצה, צובעים את הג'ל ב-kumasi blue כדי להנחית את החלבונים.מסיסות Kumasi blue צריכות לכסות את הג'ל לחלוטין. את הג'ל משאירים בשייקר למשך 20 דקות לפחות. לאחר מכן, מסירים את מסיס ה-ESI blue ומטביעים את הג'ל במסיס detain.מניחים לג'ל להישמר למשך כשעה על שייקר עד להופעת פסים בג'ל. לאחר צביעה ב-Coomassie, ניתן לנתח את הג'ל כדי לקבוע את כמות החלבון היחסית בפרקציית העל (supernatant) לעומת פרקציית המשקע (pellet). במבט על הג'ל שהופיע במסלולים אחד ושתיים, ניתן לראות את פרקציית העל ופרקציית המשקע של actin לבדו.בנתיבים שלושה וארבעה, היו לנו פרקציונות העליון והמשקע של ה-C teer tailn לבדו. בנתיבים חמישה ושש, היו לנו פרקציונות העליון והמשקע של ה-acton וה-C of tail ואינקובציה. בנתיבים שבעה ושמונה, היו לנו פרקציונות העליון והמשקע של אינקובציית חלבון actin ו-GST.כפי שניתן לראות, ה-CT של הזנב נראה רק בפרקציית החיך במסלול שש. תוצאות הג'ל הזה מעידות על קישור ספציפי של הקצה C, הזנב, ל-acton. בסרטון זה, צפיתם כיצד לבצע בדיקת co sedimentation של Acton.בדיקות שיקוע משותף של אקטין (Actin Co-sedimentation assays) הן שיטה במבחנה (in vitro) לניתוח חלבונים קושרים של אקטין. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור את הנקודות הבאות: יש לבצע ניקוי מקדים (pre-clear) לחלבון הנחקר, וכן לכלול ביקורת שלילית של החלבון לבדו עבור כל דגימה של אינקובציית אקטין עם חלבון.ביקורת זו תראה אם מי מהחלבונים שעברו ניקוי מוקדם שוקעים מעצמם, שכן קישור ל-f הפועל על ידי חלבונים מסוימים עשוי להיות רגיש ל-pH, לטמפרטורה או לריכוז המלח בתמיסת הבאפר. וזה הכל. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

actin-co-sedimentation-assay-for-analysis-protein-binding-to-f

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מיישמים ללא תווית חלבון אינטראקציה באמצעות ניתוח X100 Biacore לניתוח המבנה והתפקוד של הכריכה של מוטציות ב 'מספר cystatin כדי papain דרך אפיון קינטי. כיול ללא ניתוח ריכוז (CFCA) מודד את הריכוז של חלבון עם פעילות מחייב שמר ללא צורך עקומת סטנדרט. אנו מראים כי אישור של ריכוזי באמצעות CFCA מגבירה את האמינות של הניתוח הקינטית כי קבועים הקינטית יכול להיקבע בצורה אמינה, גם אם את פעילותו של חלבון רקומביננטי מצטמצם.

חשיבותה של ריכוז חלבון נכון עבור קינטיקס וקביעת זיקה בניתוח מבנה פונקציה

סרטון זה מתאר את הטכניקה של לימוד שלד ציטו-שלד והידבקויות מוקדיות בתאי סרטן המעי הגס האנושיים הראשוניים כדי להבין את הווריאציות שלו בהתאם לקשיחות המצע. תרבית זו של תאים סרטניים על מצעים רכים וקשים מאפשרת מדידות ביופיזיקליות שונות במורד הזרם לפרוגנוזה של סרטן.

בדיקת ארגון ציטו-שלד והדבקה מוקדית: שיטה מבוססת אימונופלואורסנציה לחקר הידבקות תאים והתפשטותם על מצעים

פילמור של FtsZ חיוני לחלוקת תאי חיידקים. בדוח זה, אנו מפרטים פרוטוקולים פשוטים לניטור פעילות פילמור FtsZ ודנים בהשפעת הרכב המאגר. ניתן להשתמש בפרוטוקולים כדי לחקור את האינטראקציה של FtsZ עם חלבונים רגולטוריים או תרופות אנטיבקטריאליות המשפיעות על פילמור FtsZ.

FtsZ פלמור מבחני: פרוטוקולים ושיקולים פשוטים

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבחון את היכולת של חלבון לשיתוף משקעים עם אקטין filamentous (F- אקטין), ואם מחייב הוא ציין, כדי למדוד את הזיקה של האינטראקציה.

מדידת חלבון מחייב F- אקטין על ידי שיתוף שקיעה

פונקציות אנדוזום מוקדם תלויים פלמור אקטין-F. כאן, אנו מתארים מבוסס מיקרוסקופיה במבחנה assay זה reconstitutes את התגרענות ואת פלמור של F-אקטין על ממברנות endosomal מוקדם במבחנות, ובכך הפך את סדרת תגובות מורכבת זו נוטה הביוכימי ותעשיה מניפולציות.

במבחנה פלמור של F-אקטין-Endosomes מוקדם

אנו מדווחים על בדיקה פשוטה, יעילה בזמן וספקטרוסקופיה מבוססת תפוקה גבוהה לכימות סיבי אקטין בדגימות ביולוגיות אקס ויוו מרקמות המוח של מכרסמים ונבדקים אנושיים.

בדיקה מבוססת ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית חסכונית בזמן להערכת מצב פולמור Actin במכרסמים ורקמות מוח אנושיות

כדי להתקדם, קונוסים צמיחה חייבים להפעיל כוחות משיכה נגד הסביבה החיצונית. דור כוחות המתיחה תלוי בדינמיקת אקטין ובצימוד מצמד. המחקר הנוכחי מתאר שיטות לניתוח דינמיקת אקטין, צימוד מצמד וכוחות משיכה להתקדמות חרוט הצמיחה.

ניתוחים של אקטין דינמיקה, מצמד צימוד וכוח המתיחה לקידום קונוס צמיחה

פרוטוקול זה מתאר את היווצרותם של דו-שכבתיות שומנים נתמכות ואת התוספת של חוטים ציטוסקטליים וחלבונים מוטוריים כדי לחקור את הדינמיקה של רשתות ציטוסקטליות משוחזרות, הקשורות לממברנה, באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

שחזור של קליפות אקטין מינימליות הקשורות לממברנה על דו-שכבתיות שומנים נתמכות

פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר כוכבי שביט אקטין על פני השטח של חרוזים תוך שימוש ברכיבי חלבון זמינים מסחרית. מערכות כאלה מחקות את המבנים הבולטים הנמצאים בתאים, וניתן להשתמש בהן כדי לבחון מנגנונים פיזיולוגיים של ייצור כוח בצורה פשוטה.

שחזור של תנועתיות מבוססת אקטין עם חלבונים זמינים מסחרית

שיטה זו מתארת בדיקת שיקוע חוץ גופית מבוססת לקטין כדי לכמת את זיקת הקישור של פוספטאז גלוקן ועמילופקטין. בדיקת שקיעה משותפת זו אמינה למדידת קשירת מצע גלוקן פוספטאז וניתן ליישם אותה על מצעים גלוקניים מסיסים שונים.

Concanavalin A מבוסס Sedimentation Assay למדידת קשירת המצע של פוספטאז גלוקני

כאן, אנו מציגים שיטות להכנת מכלולי אקטין מעין דו-ממדיים (2D) שזורים, צולבים וגבישים נוזליים מחלבונים מטוהרים.

כוונון מצבי ההתכווצות והעיוות של מכלולים מבוססי אקטין פעילים במבחנה: מרשתות פעילות דו-ממדיות לטיפות גביש נוזלי

למד את שיטת actin co-sedimentation לניתוח אינטראקציות חלבון-F-actin בתא. שיטה זו מאפשרת למדוד ספציפיות קישור ולהבין מנגנוני שלד תאי דינמיים במחקר ביולוגי.

אקטין Co-Assay שקיעה, כי ניתוח של חלבון מחייב את ה-F-אקטין

גלה סרטונים נוספים