מדידת הזדקנות תאית בודדת עם סמן ביולוגי מבוסס דימות של כרומטין והזדקנות אפיגנטית

פיתחנו כרומטין מבוסס הדמיה ודימוי גיל אפיגנטי, טכניקה חדשנית שנועדה לכמת הזדקנות והתחדשות ברזולוציה של תא יחיד. שעוני מתילציה של DNA מעריכים גיל ביולוגי, אך תלויים ברגרסיה ליניארית, זקוקים לקוהורטות גדולות, והורסים דגימות, מה שהופך אותן ליקרות ולא מתאימות למחקרים רחבי היקף או אורך. כדי להתחיל, העבר את האיברים והרקמות הקפואים למכתש מקורר מראש שמונח על קרח יבש.

שפכו חנקן נוזלי על הרקמה הקפואה וטחנו אותה היטב בעזרת עלי מקורר מראש עד שמתקבלת אבקה דקה אחידה. באמצעות מרית מתכת מקוררת מראש, מחלקים את הרקמה הטחונה למספר צינורות. לאחר חילוץ הגרעינים, מערבבים אותם עם טרייפן בלו ביחס שווה בצינור נפרד.

העבר 10 מיקרוליטר מהתערובת למכשיר המוציטומטר, או טען אותה למונה תאים אוטומטי. הזן ואמת את כל המטא-דאטה, כולל מזהי דגימות, מצבים וסמנים ביולוגיים במפת הלוחית וייצא קובץ CSV. כעת, פזר 10,000 גרעינים לכל באר בנפח של 20 עד 30 מיקרוליטר ללוח באר של 384.

צנטריפוגה את הלוח ב-1000 גרם, עם תאוצה על תשע והאטה על ארבע, למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מקבע את הגרעינים על ידי הוספת נפח שווה של 8% פאראפורמלדהיד ו-PBS, ודגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת הקיבוס, הוסף 30 מיקרוליטר של 0.1 מולר גליצין ב-PBS ודגר במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

הסר את תמיסת הגליצין ושוטף את הבארות פעמיים עם 100 מיקרוליטר של PBS. הסר את ה-PBS מכל באר והוסף 30 מיקרוליטר של תמיסת חסימה המכילה 2% BSA ו-0.5% Triton X-100 ב-PBS. דגר את הצלחת במשך שעה בטמפרטורת החדר.

לאחר הסרת תמיסת החסימה, דגרו את הדגימה ב-25 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את הבארות שלוש פעמים עם 100 מיקרוליטר של PBS, כאשר כל שטיפה נמשכת שלוש דקות בטמפרטורת החדר. הוסף 25 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים משנית ודגר במשך שעתיים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, שטפו את הבארות שלוש פעמים עם 100 מיקרוליטר של PBS, כל שטיפה נמשכת שלוש דקות בטמפרטורת החדר. צבעו את הגרעינים ב-DAPI או Hoechst על ידי הוספת 30 מיקרוליטר של הצבע בריכוז של 0.01 מיליגרם למיליליטר, ושטפו את הפלטה פעם אחת עם 100 מיקרוליטר PBS להסרת צבע עודף. הורד את סקריפטי זרימת העבודה ממאגר GitHub.

לאחר סיום ההורדה, פתח את הקובץ כדי לחלץ את תוכנו. ארגן את מאגר התמונות המשובל כך שמבנה התיקיות יתאים לפורמט שנלקח על ידי זרימת העבודה לביצוע נכון של סקריפטים. לאחר מכן, פתח את אפליקציית הטרמינל אם אתה פועל על Linux או Mac OS, או את אפליקציית WSL אם אתה משתמש ב-Windows.

שנה את תיקיית העבודה לתיקיית המאגר המשובלת על ידי הקלדת הפקודה הנדרשת בטרמינל ולחיצה על Enter. צור סביבה חישובית חדשה בשם Image_workflow באמצעות Conda עם Python גרסה 3.10 ולחץ על Enter. הפעל את סביבת Conda החדשה עם הפקודה conda activate Image_workflow.

התקן את Poetry, מנהל חבילות בפייתון, בתוך הסביבה המופעלת באמצעות מתקין PIP. לאחר מכן, התקן את כל חבילות הפייתון הנדרשות לזרימת העבודה באמצעות Poetry. כעת, הגדר את CUDA בתוך סביבת Conda כדי לאפשר פונקציונליות של יחידת עיבוד גרפית במהלך שלב הסגמנטציה.

פתח את אפליקציית הטרמינל והחלף את התיקייה לשיבוט. הפעל את סביבת Conda על ידי הקלדת הפקודה למטה ולחיצה על Enter. פתח את קובץ זרימת העבודה הראשי בעורך קוד או טקסט כמו VS Code או Notepad כדי להגדיר את פרמטרי הניתוח.

הגדר את שם הפרויקט על ידי הקצאת המשתנה p למזהה קצר של מערכת קבצים המשמש לארגון פלטים. הגדר את רשימת הערוצים להפקת תכונות ב-chs, כולל ערוץ הסגמנטציה אם נדרשות תכונות מהערוץ הזה. באמצעות ImageIndex ותווית הערוץ כמפתח, מפה את מזהה ערוץ התמונה משמות הקבצים לכותרת עמודת המיפוי הרגיש לאותיות המדויקות שנשמרה קודם.

לאחר מכן, להגדיר מיקומי נתונים על ידי הקצאת orgDataLoadPath לנתיב הנתונים, orgDataSubfolder לתיקיית התמונה אם צריך, ו-resultsSavePath לנתיב הפלט. אשר את סיומת שם הקובץ ב-imageFileFormat. לאחר מכן, ערוך imageFileRegEx כדי להשתמש בקבוצות לכידה בשם פייתון עבור החלקים הנדרשים, כולל שורה, עמודה, שדה, מיקום Z וערוץ.

כעת, הגדר את ערוץ הסגמנטציה ב-segmentation_ch לערוץ הגרעיני המשמש לגילוי עצמים. החליטו אם להשתמש בתיקון תאורה על ידי הגדרת illumiCorrection והגדרה ל-true כדי לחשב וליישם מודלים בסיסיים. לאחר מכן, להגדיר את גודל הווקסלים הפיזיים במיקרומטרים ב-voxel_dim כ-ZYX באמצעות מטא-דאטה של מיקרוסקופ.

שמרו את הקובץ וסגרו את העורך לאחר אימות כל פרמטר. לבסוף, הרץ את סקריפט זרימת העבודה כדי לקבל קריאות תמונה ולבצע אימות, תוך שמירה על הטרמינל פתוח בזמן שהסקריפט רץ. הצג תוצאות וייצא קריאות תמונה גולמיות לניתוח נוסף בתוכנה חיצונית.

תמונות מייצגות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים הראו גרעינים מופרדים בבירור עם צביעת DAPI, היסטון H3 טרימתילט בליזין 27, והיסטון H3 אצטילט בליזין 27. ניתוח תמונות של שרירי הכבד והשלד חשף הבדל משמעותי בין דגימות צעירות למבוגרים, כאשר עכברי OSKM ישנים הראו תמונה מופחתת לעומת ישנים, מה שמעיד על תכנות חלקי מחדש. ניתוח של בעלי חיים בודדים הראה שחלק מדגימות OSKM ישנות הציגו ערכי תמונה מופחתים משמעותית בהשוואה לעכברים מבוגרים.

פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לחקור שינויים הקשורים לגיל בכרומטין ובארגון אפיגנטי ברזולוציה של תא יחיד בסוגי תאים ורקמות שונות. השיטה המבוססת על הדמיה שלנו אינה הרסנית, היא שומרת על מבנה הכרומטין, מאפשרת מדידות חוזרות, ויעילה יותר מבחינה כלכלית במחקרים רחבי היקף או אורך. מחקר עתידי יתמקד בהוספת סמנים אפיגנטיים נוספים ובחקר מבנים תוך-גרעיניים הקשורים להזדקנות.