תהליך עבודה סטנדרטי של SDS-PAGE לפרופיל קורונה של חלבונים מותאם אישית בגילוי סרטן מוקדם

אנו חוקרים כיצד ננו-חלקיקים מתקשרים עם הדם כדי לחשוף סימנים מוקדמים של סרטן, במטרה לבצע בדיקה פשוטה לשחזור ובעיקר לא פולשנית. כדי להתחיל, דילל את תמיסת המקור של ארבעה מיליגרם למיליליטר של גיליונות ננו תחמוצת גרפן במים אולטרה-טהורים לריכוז הרצוי. סוניק את התמיסה המדוללת למשך שתי דקות בעוצמה של 28% עם מצב פולס של שמונה שניות דלוק ושש שניות כבוי כדי להבטיח פיזור אחיד.

כימות את ריכוז התמיסה המפוזרת באמצעות ספקטרוסקופיה נראית אולטרה סגולה. לאחר מכן מדדו את הגודל ההידרודינמי ואת פוטנציאל הזטה של התמיסה באמצעות פיזור אור דינמי עם לייזר ניאון הליום בקוטר 633 ננומטר. דילל את הדגימה במים אולטרה-טהורים בהתאם למגבלות גילוי QVet.

לאחר מכן, דיללו את הפלזמה האנושית הליופילית המסחרית במים אולטרה-טהורים לפי הצורך. צנטריפוגה את הפלזמה המחודשת ב-18, 620 גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. אסוף את הסופרנטנט ואחסן אותו בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

כעת, כמת את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת חומצה ביצינכונונית כדי להתאים את הדילול בפלזמה ולקבוע את היחס האופטימלי בין ננו-חלקיקים לפלזמה. ערבבו את נפח הננו-חלקיקים שנבחר עם פלזמה כדי להגיע ליחס היעד בין השניים. דגרו את התערובת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.

כדי לבודד את קורונה החלבון, צנטריפוגה את דגימות הפלזמה הננו-חלקיקים בטמפרטורה של 18, 620 גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. שטוף את הכדור המתקבל עם 200 מיקרוליטר של מים אולטרה-טהורים. ואז תשהה אותו ותצנטריפוגה שוב.

לאחר השטיפה הסופית, יש לאשר את קיומו של כדור קומפקטי כהוכחה לבידוד קומפלקס חלבוני ננו-חלקיקים. לאחר מכן, ערבבו את חומר ההפחתה, בופר העומס והמים כדי להגיע לנפח בופר הטעינה המחושב. תלה מחדש את הכדור בבופר הטעינה המוכן.

לאחר מכן מרתיחים את המתלה ב-100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. צנטריפוגה את הדגימה המבושלת בטמפרטורה של 18, 620 גרם בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. אסוף את הסופרנטנט לצינור חדש.

כעת, הכן את סולם החלבונים על ידי דילול תקן המשקל המולקולרי בבופר לא צבוע עם הבופר המוצבע. מדלל 10 x בופר ריצה של Tris-Glycine-SDS לריכוז כפול אחד. הרכיבו את תא האלקטרופורזה באמצעות ג'ל ללא שיפוע של ארבעה עד 20%.

לאחר מכן שפוך את הבופר הפועל עד שהוא מגיע לרמה המומלצת שציין היצרן. טעין 10 מיקרוליטר של דגימה בכל באר. ואז פיפט שבעה מיקרוליטרים של סולם לכל באר.

הפעל את הג'ל ב-150 וולט במשך כ-90 דקות בטמפרטורת החדר. שמור את תמונת הג'ל כקובץ tiff באותה תיקייה כמו הסקריפטים. ואז פתח את תהליך עיבוד הג'ל.

אני ב-MATLAB. הכניסו את שם תמונת הג'ל כשם התמונה. לאחר מכן הזן את האינדקס של נתיב סולם אחד כסימן אינדקס.

הרץ את התסריט. השלמת השלבים תוצג בחלון הפקודה וארבעה חלונות יופיעו על המסך. עכשיו, פתח את האיור הראשון עם תמונת הג'ל המקורית למעלה ותיקון שלה לאפקט הנתיב האלכסוני בתחתית.

שנו את ערכי התיקון השמאלי והימני כדי לכוון את פרמטרי התיקון. פתח איור שתיים. הוא מכיל את התמונה שתוקנה לאפקט הנתיב האלכסוני למעלה ואת התמונה שהוסרה מהרקע למטה.

כוון את ערך BKG par X בסקריפט כדי לכוון את הסרת הרקע. שימו לב שכל הנתיבים המזוהים מסומנים כקווים לבנים אנכיים באיור שתיים. כעת, פתח איור שלוש המכיל את פרופיל העוצמה של נתיב הסימון עם השיאים שזוהו משמאל והתאמה לא ליניארית עם ערך ריבוע R מימין.

בדוק שוב שמספר הפסים הצפויים בנתיב הסולם תואם למספר השיאים שזוהו בהליך ההתאמה. לאחר מכן פתח את איור ארבע המכיל את פרופילי העוצמה המנורמליים לכל הנתיבים שזוהו בג'ל. הגדר את פרמטר הייצוא ל-1 כדי לייצא את פרופילי העוצמה כפונקציות של משקלים מולקולריים בקובץ אקסל.

הרץ את התסריט. לאחר ההשלמה, תיווצר גיליון אקסל בתיקיית העבודה הכוללת את הפרופילים המוחלטים והמנורמלים כפונקציות של משקל מולקולרי בעמודה הראשונה. אחר כך פתח את קובץ Pro M של פרופילי ג'ל והריץ את הסקריפט.

ארבעה חלונות יופיעו על המסך. איור חמש פתוח הכולל את פרופילי העוצמה המוחלטת בחלק העליון ואת העוצמות הכוללות המתאימות בתחתית לכל נתיב. ואיור שש הכולל את פרופילי העוצמה המנורמליים לכל מסלול.

כאשר ציר המשקל המולקולרי מחולק לפי הטווחים שצוינו כריג בסקריפט. הגדר את נתוני הייצוא ל-1 כדי לייצא את האזורים האינטגרליים האבסולוטיים והמנורמלים. הרץ את התסריט.

לאחר השלמה, תיווצר גיליון אלקטרוני בתיקיית העבודה הכוללת את האזורים המוחלטים והמנורמלים המיוצאים בתוך טווחי המשקל המולקולרי שנקבעו. ולבסוף, פתח את פיגורים שבע ושמונה. הם מכילים את ההיסטוגרמה של אזורים מוחלטים ומנורמליים לכל נתיב, מקובצים לפי נתיב ולפי שטח בהתאמה.

הפרוטוקול המוצג כאן קובע תהליך עבודה סטנדרטי וניתן לשחזור לבידוד ואפיון של קורונה החלבון שנוצר על ננו-חלקיקים לאחר דגירה עם פלזמה. שיטה זו מניבה פרופילי עמודי SDS עקביים מאוד המסוגלים ללכוד תכונות ביולוגיות משמעותיות ואבחנתיות של כל קורונה מותאמת אישית. פרופילי עמודי SDS שהושגו בכל התנאים היו ניתנים לשחזור גבוה.

ריכוזי הפלזמה המוגברים מ-5% ל-50% הביאו לעוצמות אות חזקות יותר באזור של 30 עד 80 קילודלקטון בפרופילי עמודי SDS. תהליך הפיפטינג האוטומטי הניב פרופילים אלקטרופורטיים כמעט זהים. תחמוצת הגרפן ייצרה בעקביות פרופילי קורונה יציבים וברורים היטב, המיוחסים לשטח הפנים הגבוה שלה ולתכונותיה הטעונות.

התפלגות הגודל של דגימות תחמוצת גרפן קטנות, בינוניות וגדולות היו צרות, לא חופפות, ומרוכזות סביב 100, 300 ו-750 ננומטרים בהתאמה. פרופילי עמודי SDS של קורונות חלבונים שנוצרו על תחמוצת גרפן היו דומים בגדלים שונים. בעוד שנצפו הבדלים ברורים בין דילולים שונים, ריכוזי פלזמה נמוכים יותר יצרו רצועות אינטנסיביות יותר בטווחי משקל מולקולרי ספציפיים, המעידים על העשרה סלקטיבית של חלבונים.

בדילול פלזמה ביניים, פרופילי מדד הצפיפות חשפו הבדלים ספציפיים למחלה, במיוחד באזור של 20 עד 30 קילודאלטון שבו דגימות PDAC הראו עוצמת אות מופחתת. מודל הפרופיל המבוסס על עמוד SDS לבדו זיהה נכון גם דגימות PDAC וגם דגימות בקרה בדיוק של 83% ובאיזון בין רגישות לספציפיות. המודל האבחוני המשולב הכולל פרופילי קורונה בדף SDS ורמות CA 19 עד 9 משיג את הדיוק, הרגישות והספציפיות הגבוהים ביותר בסיווג מטופלי PDAC.

אנו משתמשים בזרימת עבודה אוטומטית, טכניקות שאינן מבוססות טכנולוגיה וכלים מבוססי בינה מלאכותית לקידום מחקר אבחוני סרטן. הפרוטוקול שלנו מהיר, ידידותי למשתמש, תואם ל-WHO, ומבטיח טביעות אצבע חלבון שחזוריות סטנדרטיות עם רלוונטיות אבחנתית חזקה.