Name: טיפולית נידחת תלוי טיפות: דרך פשוטה טופס ותרבות גופים Embryoid (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-05T22:18:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: למד שיטה פשוטה ומהירה לטעינת תאי גזע לבאריות מיקרו-מעובדות ליצירת גופים אמבריואידיים. השיטה מאפשרת שליטה מדויקת במספר התאים ההתחלתי ומפחיתה עבודה ידנית בהשוואה לשיטת הטיפה התלויה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות על התמיכה CIRM של עבודה זו. קו התא נתרם בנדיבות בבית החולים הר סיני, טורונטו, אונטריו מד&quot;ר Andras נאגי.

1. ביצוע טיפולית נידחת עובש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדפס את התבנית הרצויה על גיליון טיפולית נידחת באמצעות מדפסת הגדרה טובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופים טיפולית נידחת בבית גיליון 163 מעלות למשך כ -10 דקות, או עד התכווץ באופן מלא לאחר שרכש צורה רגילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר טיפולית נידחת עובש מתקרר, להטביע אותו באמבטיה isopropanol עד פני השטח להשלים מכוסה בקושי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות, לרסס קצת אצטון על התבנית ולנער המיכל כמה פעמים. הוסף isopropanol יותר לשטוף את עודפי אצטון לחזור על פעולה זו מספר פעמים עד טיפולית, עובש נראה נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עובש לטבול במים מזוקקים למשך 10 דקות כדי לשטוף את כל ממיס אורגני הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האוויר נקי טיפולית-עובש. Re-לחמם אותו כ -5 דקות על 163 מעלות צלסיוס זה דיו קומפקטי רצון להתאדות כל ממס הנותרים. </li></ol> 2. ביצוע PDMS microwells <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תערובת 10:01 PDMS סוכן / ריפוי, לבחוש נמרצות במשך כמה דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפולית נידחת מקום עובש בצלחת פטרי קטנות. יוצקים את תערובת PDMS עד שהוא מגיע בערך 1 / 2 ס&quot;מ מעל פני השטח עובש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת תחת פעמון ואקום לחסל את כל הבועות מתערובת PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת בתנור ב 70 ° C, למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנותקו PDMS מוצקה עובש לקשור אותה זכוכית שקופית רק על ידי הפעלת לחץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל first microwell שבב, שכן יש שאריות דיו incrusted בין PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך זה כדי לייצר שבב השני הוא דיו חינם ויש לו צורה מוגדרת יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה microwell שבב באמצעות פתרון אתנול 70%. מניחים אותו תחת מקור אור UV למשך 10 דקות כדי לחטא אותו. </li></ol> 3. תאים של השמנה microwells <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים ו לדלל אותם בתקשורת תרבות לריכוז הרצוי (תלוי כמה תאים ראשונית בארות אתה רוצה). לדוגמה, כדי לקבל כ 10-15 תאים לכל טוב (ממוצע = 11, SD = 5.4, קצב הטעינה = 93%), השתמשנו ריכוז של 8 × 10 4 תאים / מ&quot;ל. עבור בריכוז של 17 × 10 4 תאים / מ&quot;ל, נוכל לקבל בצורה אמינה בין 25 ל 35 תאים בכל טוב (ממוצע = 27.17857 SD = 7.7, קצב העמסה = 100%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות מקום שבב microwell בצינור צנטריפוגה המכילה 50 מ&quot;ל בסיס מוצק PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף על 2JDP מ&quot;ל של תמיסת התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 760 סל&quot;ד ו - 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet את הפתרון עודף ובזהירות לשטוף microwell עם פתרון 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום microwell בצלחת פטרי קטנה, נזהר תוך השבב מתוך הצינור צנטריפוגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עודף תאים באמצעות פתרון 1 X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום שבב microwell תחת מיקרוסקופ הפוכה לאמת מספר של תאים המיועדים לכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה microwell המכיל תאים בתנאים סטנדרטיים. <img src="/files/ftp_upload/old/692_2008_7_21_1/692_Figure-01.png" alt="איור-01" width="350" height="183" /></li></ol> 4. תא הדגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעל על פי פרוטוקול EB רגיל במעבדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את בינונית לאט מהצד של החדר; להימנע להפריע תא microwell. </li></ol>

<ol><li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 7, 862-869 (1995).</li>
<li>Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+development+of+blastocyst-derived+embryonic+stem+cell+lines%3A+Formation+of+visceral+yolk+sac%2C+blood+islands+and+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).</li>
<li>Park, J., Cho, C. H., Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A. W., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication-based+modulation+of+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation.</a> Lab Chip. 7, 1018-1028 (2007).</li>
<li>Koike, M., Sakaki, S., Amano, Y., Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+embryoid+bodies+of+mouse+embryonic+stem+cells+formed+under+various+culture+conditions+and+estimation+of+differentiation+status+of+such+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Characterization of embryoid bodies of mouse embryonic stem cells formed under various culture conditions and estimation of differentiation status of such bodies.</a> J Biosci Bioeng. 104, 294-299 (2007).</li>
<li>Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+differentiation+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Controlled differentiation of stem cells.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 60, 199-204 (2008).</li>
<li>Adelman, C. A., Chattopadhyay, S., Bieker, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BMP%2FBMPR%2FSmad+pathway+directs+expression+of+the+erythroid-specific+EKLF+and+GATA1+transcription+factors+during+embryoid+body+differentiation+in+serum-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The BMP/BMPR/Smad pathway directs expression of the erythroid-specific EKLF and GATA1 transcription factors during embryoid body differentiation in serum-free media.</a> Development. 129, 539-549 (2002).</li>
<li>Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, O. V., Sills, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+blastocyst+dissection+and+subsequent+cultivation+of+embryonic+stem+cells+in+a+serum%2Fcell+free+culture+system%3A+applications+and+preliminary+results+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model.</a> J Transl Med. 4, (2006).</li>
</ol>

פיתחנו שיטה תרבות פשוטה, מהירה, וניתן להרחבה לטעון מוגדרים מראש מספרי של תאים לתוך בארות microfabricated (יצוק מ-טיפולית Dinks) ולשמור אותם לפיתוח גוף embryoid. לבסוף, תאים אלה נגישים בקלות לניתוח ניסויים נוספים. שיטה זו ניתנת לכל מעבדה ואינה דורשת ציוד ייעודי כי אנחנו לייתר את הצורך photolithography. אנחנו יכולים לשנות את הגודל של microwells וכן ריכוז של תאים / בארות כדי לשנות את המספר והגודל של הגופים embryoid.

עבור התקשורת המסקלין (McCloskey מעבדה פרוטוקול): (עבור מדיה בסך הכל מוכן: 50 מ&quot;ל, 100 מ&quot;ל) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml KSR 15%: 7.5ml: 15 מ&quot;ל 1x פן, דלקת: 0.5 מ&quot;ל; 1ml 2mm-L-גלוטמין: 0.5 מ&quot;ל; NEAA 1ml: 0.5 מ&quot;ל; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul מדולל BME:. 50ul; 100ul (הוסף 35ul של BME סינון סטרילי עד 5 מ&quot;ל של PBS ו מזרק מסנן לעקר מחק לאחר 2 שבועות. הריכוז הסופי הפתרון הוא 0.1 mM)

טיפולית נידחת תלוי טיפות: דרך פשוטה טופס ותרבות גופים embryoid

Shrinky-Dink Hanging Drops: A Simple Way to Form and Culture Embryoid Bodies

גופים Embryoid (EB) הם אגרגטים של תאים עובריים. הדרך הנפוצה ביותר ליצירת אגרגטים אלה היא השיטה ירידה תלוי, גישה מייגע של pipetting מספר שרירותי של תאים לתוך צלחות היטב. אינטראקציות בין בתאי גזע בכפייה בסמיכות זה לזה מקדמת את הדור של EBS. בגלל התקשורת בכל בארות יש להחליף באופן ידני כל יום, גישה זו היא אינטנסיבית באופן ידני. יתר על כן, בגלל פרמטרים סביבתיים כולל תאים תאים, תא מסיסים אינטראקציות גורם, pH, זמינות החמצן יכול להיות פונקציות של גודל EB, אוכלוסיות תאים המתקבל טיפות תלוי המסורתי יכול להשתנות באופן דרמטי, גם כאשר בתרבית בתנאים זהים. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי אכן מספר ראשוני של התאים המרכיבים את המצרף יכולה להיות השפעה משמעותית על התמיינות בתאי גזע. פיתחנו שיטה תרבות פשוטה, מהירה, וניתן להרחבה לטעון מוגדרים מראש מספרי של תאים לתוך בארות microfabricated ולשמור אותם לפיתוח גוף embryoid. לבסוף, תאים אלה נגישים בקלות לניתוח ניסויים נוספים. שיטה זו ניתנת לכל מעבדה ואינה דורשת ציוד ייעודי. אנו להדגים שיטה זו על ידי יצירת גופים embryoid באמצעות תא אדום ניאון העכבר קו (129S6B6-F1).

אנו מציגים שיטה פשוטה ומהירה כדי לטעון מוגדרים מראש מספרי של תאים לתוך בארות microfabricated ולשמור אותם לפיתוח גוף embryoid.

טיפולית נידחת תלוי טיפות: דרך פשוטה טופס ותרבות גופים Embryoid

גופי עוברים (Embryoid bodies - EB) הם צבירים של תאי גזע עובריים. הדרך הנפוצה ביותר ליצירת צבירים אלו היא שיטת הטיפה התלויה (hanging drop method), שהיא שיטה עתירת עבודה...

גופי אמברואיד (Embroid bodies) הם צבירים של תאי גזע עובריים. הדרך הנפוצה ביותר ליצירת צבירים אלה היא שיטת הטיפה התלויה (hanging drop method). זוהי גישה עתירת עבודה הכוללת פיפטור של מספר שרירותי של תאים לתוך לוחיות בארות.התהליך דורש עבודה ידנית מאומצת מכיוון שיש להחליף ידנית את המצע ואת כל פלטת הבארים מדי יום. יתרה מכך, מחקרים עדכניים הראו כי למספר התאים הראשוני המרכיב את האגרגט עשויות להיות השפעות על התמיינות תאי גזע. בשיטה זו אין דרך לקבוע מראש את מספר התאים.בסרטון זה, נדגים דרך פשוטה ומהירה להטענת מספרים שונים של תאים לתוך בארות המיוצרות במיקרו-פבריקציה לצורך פיתוח גופי אמבסואיד (embryoid bodies). שלום, אני ג'ונתן פגאן מהמעבדה של מישל K בבית הספר להנדסה באוניברסיטת קליפורניה מרסד, ואני חסוס לונה, גם אני מהמעבדה של K. היום נראה לכם פרוצדורה ליצירת גופי אמבסואיד בתוך בארות המיוצרות במיקרו-פבריקציה באמצעות צנטריפוגה.הליך זה כולל את השלבים הבאים: יצירת התקן מיקרו, טעינת תאי הגזע והזנת תאי הגזע. אז בואו נתחיל. השלב הראשון בהליך זה הוא הכנת תבנית ה-shrinky dink באמצעות מדפסת בעלת רזולוציה גבוהה.הדפיסו את התבנית הרצויה על דפי shrinky dink. לאחר מכן, אפו את דף ה-shrinky d בטמפרטורה של 160 °C למשך כ-10 דקות או עד שיתכווץ לחלוטין ויקבל צורה סדירה. המתינו שתי דקות עד שתבנית הדיו המכווצת תתק

shrinky-dink-hanging-drops-simple-way-to-form-culture-embryoid

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרט הווידאו הזה מדגים כיצד ההתנהגות בידול במבחנה של תאים עובריים בעכבר לגופים embryoid בשיטת ירידה תלוי.

בשנת בידול במבחנה של עכבר גזע עובריים (MES) תאים שימוש בשיטה Drop Hanging

אנו מתארים שיטה פשוטה, מהירה של הפקת 3D רקמה דמוית spheroids יישום הפוטנציאל שלהם לכמת הבדלים תאים תאים אינטראקציות.

תא פשוט תלוי תרבות Drop פרוטוקול הדור של Spheroids 3D

סרטון זה מדגים בדיקה ליצירת אורגנואידים מוחיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs). תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים ליצירת גופים עובריים (EBs). ה- EBs מתורבתים על פיגום פולימרי באמצעות מדיום אינדוקציה, המקדם התמיינות לתאי גזע עצביים, תאי אב ונוירונים לא בוגרים. לבסוף, EBs מוטמעים במטריצה ומועברים למדיום תחזוקה ליצירת אורגנואידים מוחיים.

יצירת אורגנואידים מוחיים פלוריפוטנטיים המושרים שמקורם בתאי גזע

סרטון זה מדגים את התהליך של יצירת כדורי נוירונים באמצעות טכניקת תרבית טיפה תלויה. בתוך הטיפות התלויות, התאים נעים לעבר התחתית, מורכבים מעצמם למבנים תלת-ממדיים היוצרים כדורי נוירונים, שיכולים לשמש למחקרים נוירוביולוגיים.

פיתוח כדורי נוירונים בטכניקת תרבית טיפות תלויות

הסרטון מדגים את ההתמיינות של תאי גזע עובריים של עכברים (mESCs) לגוף עוברי (EBs) בשיטת הטיפה התלויה. עם השעיית תאי גזע עובריים בטיפות תלויות ודגירה, התאים מצטברים ליצירת EBs, אשר מתמיינים עוד יותר לתאי אב עצביים (NPCs) באמצעות מדיום התמיינות בתוספת חומצה רטינואית (RA).

יצירת אבות עצביים מתאי גזע עובריים של עכבר בשיטת הטיפה התלויה

סרטון זה מציג את השימוש בטכניקת הארה צידית של אור רך כדי לשפר את ההדמיה בעין בלתי של גופים עובריים, ובכך להקל על מניפולציה והעברה שלהם במהלך תרבית אורגנואידים מוחיים. הוא מבהיר את ההתקנה של תאורת אור רך, שיטות לשינויי מדיה והעברת גוף עוברי, כמו גם את ההליך לגרימת התמיינות עצבית בגופי עובר להתפתחות אורגנואידים מוחיים.

טכניקה לאופטימיזציה של תרבית אורגנואידים מוחיים באמצעות הארה צידית של אור רך

תרבית הטיפות הזקופות ex vivo היא אלטרנטיבה לטכניקות הניסוי הנוכחיות in vitro ו-in vivo. פרוטוקול זה קל לביצוע ודורש כמויות קטנות יותר של ריאגנטים, תוך מתן אפשרות לתפעל ולחקור כלי דם עובריים, מורפוגנזה ואורגנוגנזה.

שימוש<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבויות הזקופה טיפה של איברים העובר שלמים לחקר תהליכים התפתחותיים בעכבר organogenesis

כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנואידים של כליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs). פרוטוקול זה מייצר אורגנואידים בכליות תוך שבועיים. האורגנואידים של הכליות המתקבלים יכולים להיות מתורבתים בבקבוקי ספינר בקנה מידה גדול או בלוחות ערבוב מגנטיים מרובי בארות עבור גישות מקבילות לבדיקת סמים.

שיטה פשוטה ליצירת אורגנואידים של כליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

אורגנואידים מוחיים מספקים הזדמנויות חסרות תקדים לחקר התפתחות איברים ופתולוגיה של מחלות אנושיות. למרות שהצלחה רבה הושגה עם מערכות תרבית אורגנואידיות מוחיות, עדיין ישנם קשיים תפעוליים ביישום טכנולוגיה זו. הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך אורגנואידי מוחי המאפשר שינוי בינוני והעברת אורגנואידים.

הקלה על תרבית אורגנואידית מוחית באמצעות תאורת אור רך לרוחב

הפרוטוקול הנוכחי מספק הליך שלב אחר שלב לייצור, תחזוקה והזדקנות הניתנים לשכפול של אורגנואידים מוחיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אדם (iPSCs). שיטה זו מאפשרת גידול והבשלה של אורגנואידים מוחיים לתקופות ממושכות, מה שמקל על מידול תהליכים המעורבים בהזדקנות המוח ובפתוגנזה הקשורה לגיל.

ייצור רקמות חזק לתרבית ארוכת טווח של אורגנואידים במוח שמקורם ב- iPSC לחקר ההזדקנות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מקיף ליצירה וניתוח במורד הזרם של אורגנואידים במוח האנושי באמצעות ריצוף RNA חד-תאי וגרעין יחיד.

יצירה וניתוח במורד הזרם של תעתיקים חד-תאיים וגרעינים בודדים באורגנואידים במוח

למד שיטה פשוטה ומהירה לטעינת תאי גזע לבאריות מיקרו-מעובדות ליצירת גופים אמבריואידיים. השיטה מאפשרת שליטה מדויקת במספר התאים ההתחלתי ומפחיתה עבודה ידנית בהשוואה לשיטת הטיפה התלויה.

טיפולית נידחת תלוי טיפות: דרך פשוטה טופס ותרבות גופים Embryoid

גלה סרטונים נוספים