In-vitro שיקום של יוביקוויטינציה חיידקית וחיסול בתיווך VCP/p97

העבודה שלנו חושפת כיצד VCP או p97 פועל כמגן ציטוזולי מפני פתוגנים שונים שונים. זה משחרר את הפוטנציאל של VCP או p97 ליישומים טיפוליים ואסטרטגיות ביו-הנדסתיות. בנוסף לביוכימיה שגרתית, מיקרוסקופיה ברזולוציה על, קריו EM וקריו ET משמשים כדי להבין כיצד אפקטורים אלו מתארגנים על פתוגן כדי להשמיד אותם.

כדי להתחיל, לגדל את הסטרפטוקוקוס דלקת ריאות – שישה זנים סרוטיפ שני בלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני בשמרים של טוד יואיט. הזרקו חלק אחד מהתרבית הלילית לתוך 10 חלקים של מדיום שמרי טוד היואיט טרי, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני עד שהצפיפות האופטית ב-600 ננומטר מגיעה ל-0.4. לאחר מכן מערבבים 900 מיקרוליטר של תרבית דלקת ריאות סטרפטוקוקוס עם 600 מיקרוליטר של 50% גליצרול ואחסנו את מלאי הגליצרול במינוס 80 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן הפשיר מלאי טרי של סטרפטוקוקוס דלקת ריאות מטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס והחריך אותו במלואו ב-5 מיליליטר של מדיום שמרי טוד היואיט. קח בערך 10 לכוח של שבעה תאי דלקת ריאות סטרפטוקוקוס. כדי לשטוף את התאים היטב, החזירו את החיידקים שוב לבופר התגובה ובצנטריפוגה בטמפרטורה של 21,000 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

החזירו את הכדור עם ליזאט 549 של תאי יונקים. לאחר מכן הוסיפו יוביקוויטין מטוהר ואדנוזין טריפוספט מילימולר אחד, ודגרו את התערובת לשעה עד שעתיים בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס. לאחר מכן שטפו את החיידקים פעם אחת עם בופר תגובה המכיל אוריאה מולרית אחת, ואחריהם שתי שטיפות נוספות רק עם בופר התגובה.

תקן את החיידקים עם 1% פאראפורמלדהיד. לאחר הקיבוץ, דגרו את התאים ב-PBS, המכיל מיליגרם אחד למיליליטר גליצין למשך 15 דקות. ואז לשטוף פעמיים עם PBS.

הכינו תערובת תגובה על ידי שילוב יוביקוויטין עם רכיבים נדרשים נוספים בבופר התגובה. כוון את נפח תערובת התגובה הכולל ל-100 עד 150 מיקרוליטר. החזירו את החיידקים לתערובת התגובה המכילה את האנזים של יוביקוויטין, ודגרו את התעלה למשך שעתיים בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס.

לאחר שטיפת החיידקים שלוש פעמים עם בופר תגובה, המכיל אוריאה, מקבע אותם עם 1% פאראפורמלדהיד. לאחר הקיבוץ, דגרו את התאים ב-PBS, המכיל מיליגרם אחד למיליליטר גליצין למשך 15 דקות. לאחר מכן דגרו את הדגימה ב-3% BSA למשך שעה בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס, ושוטפים את הדגימה פעמיים עם PBS.

השעינו מחדש את החיידקים המאוביקוויטינים בתמיסת נוגדנים ראשונית, המוכנה בריכוזים גבוהים יותר מאלו שמשתמשים בדרך כלל בבדיקות אימונופלואורסנציה. לאחר מכן דגרו במשך שעה בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס. לאחר שטיפת החיידקים פעמיים עם PBS, הרחק אותם מחדש בנוגדן משני המתאים המשולב עם Alexa Fluor 488 ו-Alexa Fluor 555.

כעת יצוק כ-10 עד 20 מיקרוליטר של דגימת החיידקים המסומנת על סלייד זכוכית ומערבב חמישה עד עשרה מיקרוליטרים של מדיום התקנה עם או בלי DAPI. הניחו כיסוי מעל הדגימה והשתמשו בנייר טישו כדי למרוח נוזלים עודפים. שלבו שישה מיקרומולריים VCP p97 עם NPLOC4 מיקרומולרית אחת ו-UFD-1 מיקרומולרית אחת.

כוונו את נפח תערובת התגובה לכ-90 מיקרוליטר, באמצעות בופר תגובה, ודגרו על קרח במשך שעתיים. לאחר מכן, הוסף אדנוזין טריפוספט אחד עד שניים לתערובת התגובה המכילה p97 UFD-1, NPLOC4. לאחר מכן משלבים זאת עם 10 לכוח של שבעה תאי דלקת ריאות סטרפטוקוקוס מאוביקוויטינטים, ודגרו במשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

מיד לאחר הטיפול, יש לקחת אליקו של 10 מיקרוליטר מתערובת התגובה ולבצע דילול סדרתי. הניחו 10 עד 20 מיקרוליטר מכל דילול על לוחות מקדח הלב של המוח. העריך יחידות יוצרות מושבה בין נקודות הזמן של שעת אפס לשעתיים.

חשב את אחוז הקיימות של חיידקים על ידי חלוקת ספירת ה-CFU של שעתיים בספירת ה-CFU של אפס שעות וכפל ב-100. נצפה יוביקוויטינציה משמעותית של סטרפטוקוקוס ריאות כאשר טופל בליזאט תאי יונק או במערכת אנזימים מחודשת של E-1, E-2, E-3. אות יוביקוויטינציה נעדר בביקורת ונחלש משמעותית כאשר סטרפטוקוקוס ריאות יוביקוויטינט נחשף ל-OTUB1, מה שמאשר שינוי פוליאוביקוויטין קשור ל-K48.

ניתוח פרופיל קו הראה חפיפה מלאה בין אותות יוביקוויטין לחיידקים, מה שמאשר את הקולוקליזציה המרחבית שלהם. שחזור תלת-ממדי אישר את החפיפה המרחבית בין אותות יוביקוויטין לסטרפטוקוקוס ריאות. סוג פראי p97 בשילוב עם הגורמים המשותפים שלו, UFD1 ו-NPLOC4, הפחית את חיוניות החיידקים ל-10 עד 20% לאחר שעתיים, ללא קשר לשאלה אם יוביקוויטינציה בוצעה עם ליזאט תא או עם מערכת אנזימים מטוהרת.

לא נצפתה ירידה בחיוניות החיידקים כאשר יוביקוויטינציה הושמטה, כאשר p97 הושבת בחום, או כאשר השתמשו במוטנט p97 E57 8Q הבלתי פעיל קטליטי, מה שמאשר כי גם יוביקוויטינציה וגם p97 פעיל חיוניים להריגת חיידקים. המחקר שלנו פותח את הדלת כיצד ליגות יוביקוויטין E3 של המארח משנות פתוגנים שונים וחוקרת את מנגנוני האפקטורים להסרת האיומים המדבקים. לאחר מכן אנו שואפים לחקור כיצד p97 או VCP מווסת, ולהנדס אותו להגביר את פעילותו האנטיבקטריאלית.