הדמיית סידן מבוססת פלואורסצנציה בתרביות אפיתל ראשוניות בדרכי הנשימה האנושיות באמצעות סגמנטציה אוטומטית של תאים
22 במאי 2026
הדמות תאים חיים של איתות סידן משמשת בהרחבה לחקר מוביליזציה של סידן בקווי תאים יציבים שגדלים בשכבות מונולייריות. פרוטוקול זה מתאר הדמיית פלואורסצנציה של תאים חיים של איתות סידן באמצעות צבעי תאים חיים על רקמות ראשוניות מורכבות, ומשתמש גם בתוכנת למידת מכונה לכמת עוצמת הפלואורסצנציה של אלפי תאים בודדים בו-זמנית, ובכך מייעל את הניתוחים.
טרנסקריפטומיקה חד-תאית חושפת הטרוגניות באפיתל דרכי הנשימה של סיסטיק פיברוזיס. אנו מתכוונים להבין כיצד פונקציות ושינויים ספציפיים לסוג תא משפיעים על פתוגנזה של המחלה. האתגר הנוכחי הוא למדוד במדויק פרוטאומיקה ופונקציות חד-תאיות.
זה עדיין דורש פיתוח טכני. כדי להתחיל, שמרו תאי Calu-3 בבקבוקי T-25 המכילים את Eagle's Minimum Essential Medium Culture Media בתוספת 20% FBS ו-1% סטרפטומיצין פניצילין. כאשר התאים מגיעים לכ-70% מפגש (מפגש בכ-70%), שטפו את התאים בחמישה מיליליטר של PBS.
לאחר הכביסה, הוסיפו מיליליטר אחד של TrypLE ישירות לתאים והניחו את הבקבוקון באינקובטור עם טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 10 עד 15 דקות. לאחר מכן מנטרל את ה-TrypLE על ידי הוספת ארבעה מיליליטר של מדיום תרבית מלא טרי וערבב היטב את תליית התא. הלוחות את התאים ללוח של 96 בארות בנקודת מפגש של כ-90% עד 100%, כלומר כ-40,000 תאים בכל באר.
תן לתאים להיצמד לפלטת 96 בארות במהלך הלילה. החליפו מדיה כל יום והמשיכו לגדל את התאים במשך יומיים עד חמישה ימים לאחר ההתמודדות כדי לאפשר התמיינות. ביום הניסוי, שטפו את תאי Calu-3 ודגרו אותם בצבעים המתאימים.
לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר לבאר של פרובנציד בעומק 2.5 מילימולר מדולל בבופר סידן כדי לשמור על הצבע בתוך המרחב הציטופלזמי ועטוף את הפלטה בנייר אלומיניום כדי להגן עליה מהאור עד להדמיה. לתאי דרכי הנשימה הראשוניים. הסר את המדיה הבזוליטרלית מהטרנסוול ושוטף את הצד האפיקלי על ידי הוספת 300 מיקרוליטר של בופר סידן.
לאחר מכן שטפו את הצד הבזולטרלי על ידי הוספת 750 מיקרוליטר של בופר סידן. הסר את הבופר על ידי פיפטינג וחזר על השטיפה שוב משני הצדדים. לאחר מכן, דגרו את התאים ב-200 מיקרוליטר של תמיסת צבע בצד האפיקלי ו-600 מיקרוליטר בצד הבזולטרלי למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני.
במהלך הדגירה, יש להכין את הטפסיגרגין המדולל בבופר סידן כמלאי ביניים פי שלוש. כוון את הריכוז לשש מיקרומולרים כדי להגיע לריכוז סופי של שני מיקרומולרים בבאר. לאחר הדגירה, הסר את תמיסת הצבע משני החלקים האפיקליים והבזולטרליים באמצעות פיפטינג.
שטוף את התאים פעמיים עם 300 מיקרוליטר של בופר סידן בצד האפיקלי ו-750 מיקרוליטר של בופר סידן בצד הבזולטרלי. לאחר מכן הסר את הבופר על ידי פיפטינג. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של פרובנסיד בעומק 2.5 מילימולר בבופר סידן לתא האפיקלי, ולהוסיף 500 מיקרוליטר מאותו תמיסה לתא הבזולטרלי.
השאירו את הכניסה של הטרנסוול בתוך הפלטה, עטופים את כל הפלטה בנייר אלומיניום כדי להגן עליה מהאור, והניחו את הפלטה העטופה בצד להדמיה. פתח את אפליקציית פיג'י. בחר קובץ ובחר 'פתח' כדי להעלות את קובץ הווידאו.
בחלון הקופץ שנוצר, שמור על כל ההגדרות ברירת המחדל ואשר את הבחירה. אם רוצים, כוון את תצוגת התמונה על ידי בחירת תמונה, בחירת התאמה, ולחיצה על קונטרסט בהירות. שנו את הבהירות והניגודיות של ערוצי פלואורסצנציה בודדים כדי להשיג תצפית אופטימלית על התאים.
כדי להקל על מעקב תאים, מיזוג ערוצים על ידי בחירת תמונה, בחירת צבע ולחיצה על מיזוג ערוצים. בחלון הקופץ, הקצה את הקבצים המתאימים לכל ערוץ ואשר את הבחירה. למעקב, בחרו בניתוח, בחרו כלים, ופתחו את מנהל ההשקעה.
בחלון הפופ-אפ שנוצר, הפעל את אפשרויות 'הצג הכל' ו'תוויות'. באמצעות כלי הבחירה החופשית, עקבו בקפידה אחרי תאים בודדים לפי גבולות התאים והצתם הגרעיני. לאחר מכן לוחצים על מקש T כדי להוסיף כל תא מעקב לרשימת ה-ROI.
ודאו שהתאים מסומנים בכל ארבעת פינות שדה הראייה ובמרכז הווידאו. לאחר שכל התאים סומנו במדויק, בתוך חלון מנהל ההשקעה, לחץ על More ובחר Multi Measure. בחלון הפופ-אפ שנוצר, לחץ על OK כדי להתחיל את המדידה.
פתח את קובץ הווידאו בפיג'י. אופטימיזציה של ערוצי הפלואורסצנציה הגרעיניים והירוקים לצפייה באמצעות כלי התאמת התמונה. לאחר שהערוצים מותאמים, שכפל פריים אחד על ידי בחירת Image ובחירה ב-Duplicate.
בחלון הפופ-אפ שנוצר, בטל את הבחירה ב-Duplicate stack ושמור את התמונה הכפולה כקובץ תמונה PNG. חזור על שכפול המסגרות עבור הערוץ השני על ידי בחירת Image ובחירת Duplicate. בחלון הפופ-אפ, לחץ OK, ושמור את התמונה קובץ PNG.
מיזוג שתי התמונות השמורות על ידי בחירת תמונה, בחירת צבע ולחיצה על מיזוג ערוצים. לאחר מכן הקצה כל קובץ PNG לערוץ המתאים ואשר את המיזוג. העלה את התמונה המאוחדת לממשק המשתמש הפוסט-גרפי של התא כדי ליצור מסכת תא.
סגמנט את התמונה באמצעות הכתם הגרעיני כערוץ אחד, והכתם הציטופלזמי הוא בערוץ שתיים על ידי בחירת מודל cyto3. עכשיו, שמור את תמונת המסכה שנוצרה כקובץ PNG. פתח אותו בפיג'י והמיר אותו לקובץ TIFF.
לבסוף, פתח גם את קובץ המסכה וגם את קובץ הווידאו המקורי בחבילת הסידן על ידי גרירה ושחרור שלהם לממשק התוכנה. לחץ על ניתוח נתונים כדי ליצור גרף להורדה וקובץ CSV להורדה המכיל ערכי עוצמה מנורמלים וגולמיים לכל התאים המנותחים. עוצמת הפלואורסצנציה שנורמלה לבסיס עלתה לאורך זמן בתאי Calu-3 בודדים לאחר גירוי תפסיגרגין כאשר נמדדה באמצעות Fluo-4 AM ו-Cal-520 AM, ההפעלה הפלואורסצנציונית המקסימלית התלויה בסידן לאחר תפסיגרגין הייתה גבוהה משמעותית בתאי Calu-3 שנמדדו עם Cal-520 AM לעומת Fluo-4 AM. באופן דומה, תאי דרכי האוויר הראשיים והברונכיאלים הראו פלואורסצנציה נורמלית מוגברת לאורך זמן לאחר גירוי תפסיגרגין באמצעות אחד מהצבעים.
בנוסף, ההפעלה המקסימלית של פלואורסצנציה תלויה בסידן הייתה גבוהה משמעותית בתאים טעונים ב-Cal-520 AM. ניתוח מבוסס למידת מכונה זיהה וכמת שינויים בפלואורסצנציה התלויה בסידן ב-1,441 תאים בודדים, משדה ראייה יחיד. עקבות פלואורסצנציה מנורמלות שנוצרו על ידי התוכנה הראו תגובות סידן לכל 1,441 התאים שזוהו לאחר גירוי טפסיגרגין. המחקרים שלנו יסייעו בהבנת תגובות סוגי תאים שונים לסביבתם, מה שיסייע בפיתוח טיפולים ממוקדים.
הממצאים שלנו יכולים להתמקד בסוגי תאים שונים, כדי להקצות תגובות מסוימות של תאים חיים לגירויים סביבתיים. בעתיד, אנו מתכוונים לחקור כיצד האותות הספציפיים לסוג תאים במחלות ובתאים בריאים משתנים כדי לקבוע את הסוגים האחראים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לניטור אותי סידן חיים ברזולוציית תא בודד בתרביות ראשוניות של תאי אפיתל של דרכי הנשימה. השיטה משלבת שימוש בצבעי אינדיקטור פלואורסצנטיים חיצוניים, מיקרוסקופיית אפי-פלואורסצנציה מתקדמת ותוכנה חדשנית מבוססת למידת מכונה לסגמנטציה של תאים ולניתוח כמותי. גישה זו מאפשרת ניתוח מהיר, בלתי מוטה ובעל תפוקה גבוהה של שטף סידן ברקמות אפיתליאליות מורכבות, ובכך מקלה על חקר תגובות ספציפיות לסוגי תאים הרלוונטיות לפתוגנזה של מחלות ולפיתוח טיפולים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה של התא
- סיגנלינג של סידן
- מחקר על אפיתל דרכי הנשימה
- דימוי וניתוח חישובי
רקע
- סיגנלינג של סידן חיוני לתהליכים ביולוגיים רבים.
- חקר זרימת סידן ברזולוציה של תא בודד בתרביות אפיתליאליות ראשוניות הוא מאתגר מבחינה טכנית.
- לשיטות קיימות חסרה לעיתים קרובות היכולת להבחין בתגובות של תאים בודדים ברקמות מורכבות.
- למידת מכונה מציעה הזדמנויות חדשות לניתוח נתוני דימוי ללא הטיות ובספיקת נתונים גבוהה.
מטרת המחקר
- פיתוח ותיקוף של פרוטוקול לדימות סידן בתאים חיים בתרביות ראשוניות של תאי אפיתל של דרכי הנשימה.
- מתן אפשרות לניתוח של גיוס סידן ברזולוציה של תא בודד באמצעות תאים המופקים ממטופלים.
- הצגת תוכנה מבוססת למידת מכונה לסגמנטציה אוטומטית של תאים ולכימות פלואורסצנציה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גידול של תאי Calu-3 ותאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה בממשק אוויר-נוזל (ALI).
- טעינת תאים בצבעי אינדיקטור פלואורסצנטיים חיצוניים לסידן (Fluo-4 AM ו-Cal-520 AM).
- גירוי באמצעות thapsigargin להשראת גיוס סידן.
- מיקרוסקופיה אפי-פלואורסצנטית לדימוי חי של זרימת סידן.
- סגמנטציה של תאים באופן ידני ועל בסיס למידת מכונה באמצעות Fiji ותוכנה מותאמת אישית.
- ניתוח כמותי של שינויים בעוצמת הפלואורסצנציה ברמה של תא בודד.
תוצאות עיקריות
- הן תאי Calu-3 והן תאי דרכי נשימה ראשוניים הראו עלייה בפלואורסצנציה מנורמלת לאחר גירוי ב-thapsigargin, מה שמעיד על גיוס סידן.
- צבע Cal-520 AM סיפק הפעלה מקסימלית של פלואורסצנציה תלוית-סידן גבוהה משמעותית בהשוואה ל-Fluo-4 AM.
- ניתוח מבוסס למידת מכונה אפשר זיהוי וכימות של תגובות סידן ב-1,441 תאים בודדים משדה ראיה אחד.
- עקומות פלואורסצנציה מנורמלות חשפו תגובות סידן מובחנות בכל התאים שנותחו.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר ניתוח מהיר, בלתי מוטה ובעל תפוקה גבוהה של איתות סידן ברזולוציה של תא בודד בתרביות אפיתליאליות ראשוניות.
- סגמנטציה וניתוח מבוססי למידת מכונה משפרים את הדיוק ואת יכולת ההרחבה של מחקרי תא בודד.
- גישה זו מקלה על זיהוי תגובות ספציפיות לסוג התא, ובכך תומכת במחקרים עתידיים על מנגנוני מחלה וטיפולים ממוקדים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימיון סידן כמותי ברמה של תא בודד בתרביות ראשוניות של תאי אפיתל ממסילת הנשימה האנושית נותן מענה לפער קריטי בהבנת איתותים ספציפיים לסוגי תאים הרלוונטיים לפתוגנזה של מחלות נשימה. סגמנטציה אוטומטית של תאים באמצעות למידת מכונה מאפשרת ניתוח רחב היקף ובלתי מוטה, התומך בביטחון חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים ובתיקוף של מטרות טיפוליות. יכולת זו משפרת את קבלת ההחלטות לגבי תיק הפיתוח על ידי הבהרת ההטרוגניות התפקודית ומאפשרת רציפות תרגומית משלב הגילוי למחקר הפרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של מסלולי איתות סידן ספציפיים לסוגי תאים ברקמות אנושיות ראשוניות.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי כימות הטרוגניות תפקודית ברזולוציית תא בודד.
- מסייע בהגברת הביטחון החזוי בתיקוף מטרה באמצעות קריאות כמותיות ואמינות.
- מספק תובנה מכניסטית לגבי תגובות תאיות רלוונטיות למחלה לצורך תעדוף תיקי פיתוח.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מכין מערכות אפיתליאליות מתוקפות ורלוונטיות פיזיולוגית לצורך תהליכי סריקה בהמשך השלבים.
- מספק תוצרי בדיקה כמותיים, ניתנים לשחזור וסטנדרטיים המבוססים על פלואורסצנציה.
- מאפשר ניתוח אוטומטי בקיבולת גבוהה המתאים להערכה ניתנת להרחבה של תרכובות.
- תומך בשימוש חוזר בפלטפורמת הבדיקה על פני מודלים שונים של מחלות דרכי הנשימה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים קריאות תפקודיות של תאים בודדים לסמנים ביולוגיים רלוונטיים למחלה באפיתל דרכי הנשימה.
- שומר על רציפות תרגומית מתרביות המופקות מחולים ועד לתיקוף פרה-קליני.
- מסייע בקבלת החלטות על קידום מבוסס סיכונים באמצעות הבהרת תגובות ספציפיות לסוגי תאים.
- מפחית סיכונים בהנחות מכניסטיות לפני מחקרים in vivo.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטה זו משלבת שלבים החל מגילוי מוקדם, דרך זיהוי מובילים (lead identification) ועד למחקר פרה-קליני, ומספקת תזרים עבודה הניתן לשימוש חוזר לצורך ניתוח תפקודי במודלים של דרכי נשימה ראשוניים בבני אדם.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובהבהרת מסלולים ביולוגיים באמצעות כימות זרימת סידן בסוגי תאים בודדים.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך בדיקת מוכנות של בדיקות (assays) והערכת תרכובות.
- אנליזה: מספק מדידות נורמליזציה של עוצמת פלואורסצנציה ותוצאות סטטיסטיות להשוואה איתנה בין תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין תגובות של תאים בודדים in vitro לבין סממנים ביולוגיים תרגומיים הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס יכולת אוטומטית וניתנת להרחבה לשימוש חוזר בתיקי מחקרים של מחלות דרכי הנשימה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה ואוטומציה של ניתוח תאי-בודד (single-cell) לשיפור השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability).
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת יותר לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) ויעילות הונית על ידי הבהרת ההטרוגניות התפקודית.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום תוכניות למחלות נשמיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדימות תאים חיים, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ואנליזה חישובית.
- תלוי בגישה למיקרוסקופים אפי-פלואורסצנטיים ותוכנה לסגמנטציה מבוססת למידת מכונה.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי הדימות והאנליזה בין צוותים שונים.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור מקורות רקמה ראשוניים שונים או מודלים של מחלות.
- התפוקה והיכולת להרחבה מושפעות מהתשתיות של הדימות ומהמשאבים החישובים.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:23
Calu-3 Cell Culturing for Live Calcium Imaging
1:40
Loading Calu-3 Cells and the Primary Airway Cells with Cal-520 AM or Fluo-4 AM
3:51
Calcium Imaging Analysis Using the Fiji Software
5:28
Calcium Imaging Analysis Using the Calcium Suite
7:13
Results
8:31
Conclusion
