הליך דגימה מבוסס חוט אדום פנול לליפידומיקה של נוזל דמעות לא ממוקד בגילוי סמנים ביולוגיים
12 בדצמבר 2025
פרוטוקול זה מתאר פרוטוקול קליני ייחודי לאיסוף דגימות נוזלי דמעות אנושיות באמצעות חוטי פנולים אדומים ותהליך עבודה מבוסס כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם (LC-MS/MS) לגילוי פרופיל הליפידומי של הקרע. שיטת ההפרדה הדו-פאזית של מתיל טרט-בוטיל (MTBE)/מתנול מאפשרת חילוץ מהיר מליפידים מדרע עם התאוששות גבוהה לגילוי סמן ביולוגי של דמעות.
הקמנו שיטה סטנדרטית וקלה יותר מבוססת חוט אדום פנול כדי לסייע בהשגת פרופילים ליפידומיים של קרעים ששכפולים לגילוי ביומרקרים עתידיים של קרע. האתגר הנוכחי הוא שרצועות שירמר גורמות לגירוי בעוד שבנימים יש שונות במפעילים באיסוף הדמעות. דבר זה פוגע בדיווח ניסיוני ובהשוואות בין מחקרים.
כדי להתחיל, לבש כפפות וחטא היטב את תחנת העבודה כדי למנוע זיהום של הדגימה. החזק את חוט הפנול האדום בקצה מול הקרס המעוקל, ודא שלא נוגע באזור הקרס המעוקל. בקש מהנבדק להפנות את מבטו לכיוון האף העליון.
לאחר מכן מושכים בעדינות את העפעף התחתון של הנבדק, ומכניסים את החוט האדום הפנולי עם הקרס המעוקל הממוקם בלחמית הטמפורלית התחתונה ליד הפינה החיצונית של העין. כעת, בקש מהנבדק לעצום עיניים בעדינות ולהטות את ראשו מעט קדימה כדי למנוע מהחוט האדום הפנולי לגעת בעור הפנים. משכו שוב את העפעף התחתון של הנבדק, והסירו בעדינות את החוט האדום הפנולי, תוך הימנעות ממגע עם האזור שנדגם.
רשמו את אורך האזור האדום שנדגם. ובאמצעות מלקחיים סטריליים, העבר את ה-PRT לצינור דגימה חדש. עכשיו תתייג ומכסה את צינור הדגימה כמו שצריך.
אם אורך הדגימה קטן מ-50 מילימטרים, בקשו מהנבדק לנוח דקה עד שלוש ואז חזרו על איסוף נוזל הדמעות באותה עין. שים כל PRT שנדגם לאחרונה בצינור דגימה נפרד. באמצעות מתנול ומגבוני נייר נקיים, נקה היטב את הכפפות והמלקחיים כדי להסיר שאריות קרעים או מזהמים.
ואז תן להם להתייבש באוויר לגמרי. אטום את כל צינורות הדגימה עם פרפילם ואחסן אותם מיד בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס לאחסון זמני או מינוס 80 מעלות צלזיוס לאחסון ארוך טווח. שטוף מראש את המספריים המיקרו והמלקחיים עם מתנול לפני עיבוד חוטי הפנול האדומים.
חתכו את קצה הקרס המעוקל בערך בשלושת המילימטרים הראשונים מכל חוט פנול אדום. חתכו את האזור שנלקח עד חזית צבע הפנול האדום לחתיכות של שני מילימטרים ואסופו את המקטעים הללו עם צינור מיקרוצנטריפוגה אורגני נקי בנפח 1.5 מיליליטר עמיד לממס. השליכו את קצה הקרס המעוקל ואת האזור הלא רצוי של PRT.
מניחים את הדגימות על קרח כדי לשמור על טמפרטורה נמוכה לפני החילוץ. כעת, הוסף 232 מיקרוליטר של מתנול בדרגת ספקטרומטריית מסה קרח לכל דגימה ומערבובת למשך 15 שניות כדי לערבב היטב. סוניק את הדגימות בניקוי אולטרסוני מקורר מראש למשך 15 דקות.
לאחר מכן הוסיפו 774 מיקרוליטר של מתיל טרט-בוטיל אתר בדרגת HPLC ו-194 מיקרוליטר של מים דה-יוניים לכל דגימה. תפעיל שוב Vortex ל-15 שניות כדי לערבב היטב את הממסים. סוניקציה נוספת של הדגימות בניקוי אולטרסוני מקורר מראש לעוד 15 דקות.
לאחר הסוניקציה, דגרו את הדגימות ב-ThermoMixer על ארבע מעלות צלזיוס עם ניעור במהירות של 1,200 סיבובים לדקה למשך שמונה שעות. לאחר מכן נותנים לתערובת לעמוד בטמפרטורת החדר ללא הפרעה במשך 10 דקות. צנטריפוגה את התערובות ב-10,000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר הצנטריפוגה, ודאו שהתערובות מופרדות לעין לשני פאזות נוזליות מובחנות. אסוף בזהירות 700 מיקרוליטר של השלב האורגני העליון המכיל ליפידים והעבר אותם לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש מקורר מראש בנפח 1.5 מיליליטר. השליכו את הפאזה המימית התחתונה, המכילה שאריות מתיל טרט-בוטיל אתר ומתנול כפסולת כימית מסוכנת.
ייבשו את תמציות השומנים באמצעות מרוכז SpeedVac מקורר על ארבע מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. לאחר מכן שמרו את תמציות השומן היבשות בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס לאחסון קצר טווח או מינוס 80 מעלות צלזיוס לאחסון ארוך טווח. הכינו את תערובת הממס של מתנול-כלורופורם על ידי ערבוב מתנול עם כלורופורם ביחס נפח של אחד לאחד.
שחזור תמציות השומנים היבשות באמצעות 50 מיקרוליטר של תערובת מתנול-כלורופורם קרה. סוניקט את התמיסה המחודשת בניקוי אולטרסוני מקורר מראש למשך 15 דקות. כעת, צנטריפוגה את תמציות השומן המחודשות בטמפרטורה של 14,000 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
העבר בזהירות 40 מיקרוליטר מהסופרנטנט המתקבל לבקבוקון זכוכית אוטוסמפלר המצויד בתוספת זכוכית. סגור היטב את הבקבוקון עם מכסה פתוח ללא מחיצה כדי להכין אותו לניתוח ספקטרומטריית מסה טנדם בכרומטוגרפיה נוזלית. באמצעות קריטריונים מחמירים, זוהו 773, 890 ו-1,025 מיני שומנים ייחודיים בקבוצות דגימה משוכפלות אחת, שכפולה שתיים ושלוש קבוצות מדגימות משוכפלות בהתאמה.
מצב יון חיובי זיהה 1,302 מיני שומנים עם זיהויים בדרגה A של 26%, 13.2% דרגה B ו-60.8% דרגת C. מצב יוני שלילי זיהה 257 מיני שומנים עם זיהויים של כ-8.2% דרגה A, 22.9% דרגת B, ו-68.9% דרגת C. למרות שונות הקשורה לאחסון, זוהו בעקביות 394 מיני שומנים ייחודיים בכל שלושת קבוצות המדגם.
מקדם השונות הבין-נבדקת בשלושה ביקורים היה 21.5% במצב חיובי ו-31.3% במצב שלילי. פרוטוקול זה מטפל בהיעדר תהליך עבודה סטנדרטי לניתוח ליפידומי קרע שניתן לשחזור ויכול לשפר את ההשוואה בין המחקרים. השיטה המבוססת על PRT שלנו מפחיתה גירוי ומאפשרת איסוף קרעים מהיר ומפחיתה את השונות של המפעילים.
המחקר העתידי שלנו יאמת סמנים ביוגרפיים של קרעים בקבוצות גדולות וישלב מולטיאומים לאבחון מותאם אישית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתואר שיטה סטנדרטית לאיסוף דגימות של נוזל דמעות אנושי באמצעות חוטי פנול רד (phenol red), במטרה להגביר את השחזוריות במחקרי ליפידומיה של הדמעות. זרימת העבודה משלבת כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסות בטן (LC-MS/MS) לצורך מיצוי ואנליזה של ליפידים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביוכימיה
- מחקר קליני
רקע
- שיטות נוכחיות לאיסוף דמעות מובילות לעיתים קרובות לגירוי או לשונות בתוצאות.
- סטנדרטיזציה היא קריטית לגילוי אמין של סמנים ביולוגיים.
- חוטי פנול אדום (Phenol red threads) מהווים חלופה פחות פולשנית לדגימת דמעות.
- LC-MS/MS מספקת פלטפורמה חסונה לניתוח ליפידומיה.
מטרת המחקר
- ביסוס שיטה הניתנת לשחזור עבור פרופיל ליפידומיה של דמעות.
- צמצום השונות בין המפעילים ושיפור ההשוואתיות בין מחקרים.
- סבסוב מחקר עתידי על סמני ליפידים (lipid biomarkers) בדמעות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף דגימות דמעות באמצעות חוטים של פנול אדום.
- מיצוי ליפידים באמצעות שיטת הפרדה דו-פאזית.
- ניתוח של סוגי ליפידים באמצעות LC-MS/MS.
- אחסון דגימות בטמפרטורות מבוקרות לשמירה על היציבות.
תוצאות עיקריות
- זיהוי של למעלה מ-1,300 סוגי ליפידים במצב יונים חיובי.
- זיהוי עקבי של 394 סוגי ליפידים ייחודיים לאורך הדגימות.
- שונות בין-נבדקים שנמדדה ב-21.5% במצב חיובי.
- השיטה משפרת את השחזוריות ואת היכולת להשוות בין מחקרי ליפידומיקה.
מסקנות
- שיטת חוט הפנול אדום מפחיתה גירוי ושונות.
- זרימת עבודה סטנדרטית משפרת את האמינות של ניתוח ליפידומי של דמעות.
- מחקרים עתידיים יתמקדו בתיקוף של סממנים ליפידיים בקוהורטים גדולים יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דגימה סטנדרטית ופולשנית באופן מינימלי של נוזל דמעות היא קריטית לגילוי רב-מרכיבי של סממנים ליפידומים במחקרים על מחלות עיניות ומערכתיות. הפרוטוקול המבוסס על חוט פנול אדום (PRT) נותן מענה לסוגיות של שחזור ושונות בין מפעילים, ובכך מאפשר ביטחון ניבוי גבוה יותר בתיקוף מוקדם של סממנים ביולוגיים. זרימת עבודה זו תומכת ברציפות תרגומית משלב הגילוי ועד למחקר פרה-קליני, על ידי הבטחת נתונים ליפידומיים עקביים ואיכותיים לאורך מחקרים ואתרים שונים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה הדירה של פרופילי ליפידים בדמעות לצורך בדיקת השערות לגבי סמנים ביולוגיים.
- מפחית שונות ביולוגית ופרוצדורלית, ובכך תומך בתיקוף של מטרות תפקודיות.
- מסייע במיון תיקי פיתוח באמצעות אספקת מערכי נתונים ליפידומיים כמותיים ומהימנים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מכין דגימות מאומתות של נוזל דמעות עבור תהליכי עבודה של LC-MS/MS ברזולוציה גבוהה בשלבים הבאים.
- משפר את הדירות והסטנדרטיזציה של הבדיקה על ידי מזעור השונות התלויה במבצע.
- תומך באיסוף דגימות בר-הרחבה וידידותי למשתמש, המתאים למחקרים רב-מרכזיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאם תוצרי ליפידומיה עם גילוי וניטור של סמנים ביולוגיים הרלוונטיים למחלה.
- מאפשר רציפות משלב הגילוי המוקדם ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי תמיכה באיכות דגימות עקבית.
- מפחית את הסיכון לתוצאות שגויות שליליות במחקרי סמנים ביולוגיים תרגומיים עקב ארטיפקטים של דגימה.
שילוב תהליכי עבודה ופייפליין
פרוטוקול הדגימה המבוסס על PRT משתלב ברצף גילוי הביומארקרים, החל מבדיקת השערות מוקדמת ועד לתיקוף פרה-קליני, על ידי אספקת קלט סטנדרטי לניתוח ליפידומיה.
- ביולוגיה של התגליות: תומך בפרופיל ליפידומי מונחה-השערות ובבירור מסלולים במודלים של מחלות עיניות ומערכתיות.
- סריקה: מספק דגימות ליפידים של דמעות כמותיות וניתנות לשחזור לצורך ניתוח LC-MS/MS בסריקה רחבה.
- אנליטיקה: מאפשר זיהוי והשוואה של למעלה מ-700 מיני ליפידים ייחודיים בין חזרות ותנאים שונים.
- מחקר טרנסלציונלי: מקל על התאמת סממנים ביולוגיים וניטור מחלות באמצעות דגימה חסונה ומינימלית פולשנית.
- שימוש חוזר ארגוני: מספק פרוטוקול סטנדרטי וניתן להרחבה שניתן להתאימו לצוותי מחקר ולקבוצות קליניות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי סמנים ביולוגיים של ליפידים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של איסוף נוזל דמעות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי הפחתת סיכונים הקשורים לדגימה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של תוכניות לסמנים ביולוגיים.
שיקולי יישום
- דורש כוח אדם המוכשר לטיפול ב-PRT סטנדרטי ועיבוד דגימות.
- דורש גישה למכשירים מסוג LC-MS/MS ברזולוציה גבוהה ולתוכנה לליפידומיה.
- דורש הקפדה של כל הצוותים על פרוטוקולי בקרה למניעת זיהום ואחסון.
- ניתן להתאמה עבור נבדקים עם נפח דמעות נמוך או רגישות לשיטות דגימה מסורתיות.
- מגבלות פוטנציאליות כוללות שונות ליפידית הקשורה לאחסון וצורך בתיקוף נוסף בקוהורטים גדולים.
