הליך דגימה מבוסס חוט אדום פנול לליפידומיקה של נוזל דמעות לא ממוקד בגילוי סמנים ביולוגיים
December 12th, 2025
פרוטוקול זה מתאר פרוטוקול קליני ייחודי לאיסוף דגימות נוזלי דמעות אנושיות באמצעות חוטי פנולים אדומים ותהליך עבודה מבוסס כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם (LC-MS/MS) לגילוי פרופיל הליפידומי של הקרע. שיטת ההפרדה הדו-פאזית של מתיל טרט-בוטיל (MTBE)/מתנול מאפשרת חילוץ מהיר מליפידים מדרע עם התאוששות גבוהה לגילוי סמן ביולוגי של דמעות.
הקמנו שיטה סטנדרטית וקלה יותר מבוססת חוט אדום פנול כדי לסייע בהשגת פרופילים ליפידומיים של קרעים ששכפולים לגילוי ביומרקרים עתידיים של קרע. האתגר הנוכחי הוא שרצועות שירמר גורמות לגירוי בעוד שבנימים יש שונות במפעילים באיסוף הדמעות. דבר זה פוגע בדיווח ניסיוני ובהשוואות בין מחקרים.
כדי להתחיל, לבש כפפות וחטא היטב את תחנת העבודה כדי למנוע זיהום של הדגימה. החזק את חוט הפנול האדום בקצה מול הקרס המעוקל, ודא שלא נוגע באזור הקרס המעוקל. בקש מהנבדק להפנות את מבטו לכיוון האף העליון.
לאחר מכן מושכים בעדינות את העפעף התחתון של הנבדק, ומכניסים את החוט האדום הפנולי עם הקרס המעוקל הממוקם בלחמית הטמפורלית התחתונה ליד הפינה החיצונית של העין. כעת, בקש מהנבדק לעצום עיניים בעדינות ולהטות את ראשו מעט קדימה כדי למנוע מהחוט האדום הפנולי לגעת בעור הפנים. משכו שוב את העפעף התחתון של הנבדק, והסירו בעדינות את החוט האדום הפנולי, תוך הימנעות ממגע עם האזור שנדגם.
רשמו את אורך האזור האדום שנדגם. ובאמצעות מלקחיים סטריליים, העבר את ה-PRT לצינור דגימה חדש. עכשיו תתייג ומכסה את צינור הדגימה כמו שצריך.
אם אורך הדגימה קטן מ-50 מילימטרים, בקשו מהנבדק לנוח דקה עד שלוש ואז חזרו על איסוף נוזל הדמעות באותה עין. שים כל PRT שנדגם לאחרונה בצינור דגימה נפרד. באמצעות מתנול ומגבוני נייר נקיים, נקה היטב את הכפפות והמלקחיים כדי להסיר שאריות קרעים או מזהמים.
ואז תן להם להתייבש באוויר לגמרי. אטום את כל צינורות הדגימה עם פרפילם ואחסן אותם מיד בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס לאחסון זמני או מינוס 80 מעלות צלזיוס לאחסון ארוך טווח. שטוף מראש את המספריים המיקרו והמלקחיים עם מתנול לפני עיבוד חוטי הפנול האדומים.
חתכו את קצה הקרס המעוקל בערך בשלושת המילימטרים הראשונים מכל חוט פנול אדום. חתכו את האזור שנלקח עד חזית צבע הפנול האדום לחתיכות של שני מילימטרים ואסופו את המקטעים הללו עם צינור מיקרוצנטריפוגה אורגני נקי בנפח 1.5 מיליליטר עמיד לממס. השליכו את קצה הקרס המעוקל ואת האזור הלא רצוי של PRT.
מניחים את הדגימות על קרח כדי לשמור על טמפרטורה נמוכה לפני החילוץ. כעת, הוסף 232 מיקרוליטר של מתנול בדרגת ספקטרומטריית מסה קרח לכל דגימה ומערבובת למשך 15 שניות כדי לערבב היטב. סוניק את הדגימות בניקוי אולטרסוני מקורר מראש למשך 15 דקות.
לאחר מכן הוסיפו 774 מיקרוליטר של מתיל טרט-בוטיל אתר בדרגת HPLC ו-194 מיקרוליטר של מים דה-יוניים לכל דגימה. תפעיל שוב Vortex ל-15 שניות כדי לערבב היטב את הממסים. סוניקציה נוספת של הדגימות בניקוי אולטרסוני מקורר מראש לעוד 15 דקות.
לאחר הסוניקציה, דגרו את הדגימות ב-ThermoMixer על ארבע מעלות צלזיוס עם ניעור במהירות של 1,200 סיבובים לדקה למשך שמונה שעות. לאחר מכן נותנים לתערובת לעמוד בטמפרטורת החדר ללא הפרעה במשך 10 דקות. צנטריפוגה את התערובות ב-10,000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר הצנטריפוגה, ודאו שהתערובות מופרדות לעין לשני פאזות נוזליות מובחנות. אסוף בזהירות 700 מיקרוליטר של השלב האורגני העליון המכיל ליפידים והעבר אותם לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש מקורר מראש בנפח 1.5 מיליליטר. השליכו את הפאזה המימית התחתונה, המכילה שאריות מתיל טרט-בוטיל אתר ומתנול כפסולת כימית מסוכנת.
ייבשו את תמציות השומנים באמצעות מרוכז SpeedVac מקורר על ארבע מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. לאחר מכן שמרו את תמציות השומן היבשות בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס לאחסון קצר טווח או מינוס 80 מעלות צלזיוס לאחסון ארוך טווח. הכינו את תערובת הממס של מתנול-כלורופורם על ידי ערבוב מתנול עם כלורופורם ביחס נפח של אחד לאחד.
שחזור תמציות השומנים היבשות באמצעות 50 מיקרוליטר של תערובת מתנול-כלורופורם קרה. סוניקט את התמיסה המחודשת בניקוי אולטרסוני מקורר מראש למשך 15 דקות. כעת, צנטריפוגה את תמציות השומן המחודשות בטמפרטורה של 14,000 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
העבר בזהירות 40 מיקרוליטר מהסופרנטנט המתקבל לבקבוקון זכוכית אוטוסמפלר המצויד בתוספת זכוכית. סגור היטב את הבקבוקון עם מכסה פתוח ללא מחיצה כדי להכין אותו לניתוח ספקטרומטריית מסה טנדם בכרומטוגרפיה נוזלית. באמצעות קריטריונים מחמירים, זוהו 773, 890 ו-1,025 מיני שומנים ייחודיים בקבוצות דגימה משוכפלות אחת, שכפולה שתיים ושלוש קבוצות מדגימות משוכפלות בהתאמה.
מצב יון חיובי זיהה 1,302 מיני שומנים עם זיהויים בדרגה A של 26%, 13.2% דרגה B ו-60.8% דרגת C. מצב יוני שלילי זיהה 257 מיני שומנים עם זיהויים של כ-8.2% דרגה A, 22.9% דרגת B, ו-68.9% דרגת C. למרות שונות הקשורה לאחסון, זוהו בעקביות 394 מיני שומנים ייחודיים בכל שלושת קבוצות המדגם.
מקדם השונות הבין-נבדקת בשלושה ביקורים היה 21.5% במצב חיובי ו-31.3% במצב שלילי. פרוטוקול זה מטפל בהיעדר תהליך עבודה סטנדרטי לניתוח ליפידומי קרע שניתן לשחזור ויכול לשפר את ההשוואה בין המחקרים. השיטה המבוססת על PRT שלנו מפחיתה גירוי ומאפשרת איסוף קרעים מהיר ומפחיתה את השונות של המפעילים.
המחקר העתידי שלנו יאמת סמנים ביוגרפיים של קרעים בקבוצות גדולות וישלב מולטיאומים לאבחון מותאם אישית.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה סטנדרטית לאיסוף דגימות נוזל דמעות אנושי באמצעות חוטי פנול אדום, שמטרתה לשפר את הניתנות לשחזור במחקרים ליפידומיים של דמעות. תהליך העבודה משלב כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה בטנדם (LC-MS/MS) לחילוץ ניתוח שומנים.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירולוגיה
- ביוכימיה
- מחקר קליני
רקע
- שיטות עכשוויות לאיסוף דמעות לעיתים קרובות מובילות לגירוי או לשונות.
- סטנדרטיזציה היא חיונית לגילוי סמנים ביולוגיים אמינים.
- חוטי פנול אדום מציעים חלופה פחות פולשנית לדגימת דמעות.
- LC-MS/MS מספק פלטפורמה חזקה לניתוח ליפידומי.
מטרת המחקר
- להקים שיטה ניתנת לשחזור לפרופיל ליפידומי של דמעות.
- להפחית את השונות של המפעיל ולשפר את ההשוואתיות בין מחקרים.
- להקל על מחקר עתידי על סמנים ביולוגיים של שומנים בדמעות.
שיטות ששימשו
- איסוף דגימות דמעות באמצעות חוטי פנול אדום.
- חילוץ שומנים באמצעות שיטת הפרדה דו-פאזית.
- ניתוח של מינים שומניים באמצעות LC-MS/MS.
- אחסון של דגימות בטמפרטורות מבוקרות לצורך יציבות.
תוצאות עיקריות
- זיהוי של מעל 1,300 מיני שומנים במצב יון חיובי.
- זיהוי עקבי של 394 מינים שומניים ייחודיים בכל הדגימות.
- שונות בין נבדקים שנמדדה ב-21.5% במצב חיובי.
- השיטה משפרת את הנתינה לשחזור והשוואתיות של מחקרים ליפידומיים.
מסקנות
- שיטת חוטי הפנול האדום מפחיתה גירוי ושונות.
- תהליך העבודה הסטנדרטי משפר את האמינות של ניתוח ליפידומי של דמעות.
- מחקרים עתידיים יתמקדו באימות סמנים ביולוגיים ליפידומיים בקבוצות גדולות יותר.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Standardized, minimally invasive tear fluid sampling is critical for robust lipidomic biomarker discovery in ocular and systemic disease research. The phenol red thread (PRT)-based protocol addresses reproducibility and operator variability, enabling higher predictive confidence in early biomarker validation. This workflow supports translational continuity from discovery to preclinical research by ensuring consistent, high-quality lipidomic data across studies and sites.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables reproducible interrogation of tear lipid profiles for biomarker hypothesis testing.
- Reduces biological and procedural variability, supporting functional target validation.
- Facilitates portfolio triage by providing robust, quantitative lipidomic datasets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tear fluid samples for downstream high-resolution LC-MS/MS workflows.
- Improves assay reproducibility and standardization by minimizing operator-dependent variability.
- Supports scalable, user-friendly sample collection suitable for multi-site studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns lipidomic outputs with disease-relevant biomarker discovery and monitoring.
- Enables continuity from early discovery through preclinical validation by supporting consistent sample quality.
- Reduces risk of false negatives in translational biomarker studies due to sampling artifacts.
Pipeline & Workflow Integration
The PRT-based sampling protocol integrates into the biomarker discovery continuum, from early hypothesis testing to preclinical validation, by providing a standardized input for lipidomic analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven lipidomic profiling and pathway clarification in ocular and systemic disease models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative tear lipid samples for high-throughput LC-MS/MS analysis.
- Analytics: Enables identification and comparison of over 700 unique lipid species across replicates and conditions.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and disease monitoring through robust, minimally invasive sampling.
- Enterprise Reuse: Provides a scalable, standardized protocol adaptable across research teams and clinical cohorts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in lipid biomarker studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of tear fluid collection.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by reducing sampling-related risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of biomarker programs.
Implementation Considerations
- Requires personnel trained in standardized PRT handling and sample processing.
- Needs access to high-resolution LC-MS/MS instrumentation and lipidomics software.
- Demands cross-team adherence to contamination control and storage protocols.
- Adaptable to subjects with low tear volume or sensitivity to traditional sampling methods.
- Potential limitations include storage-related lipid variability and need for further validation in large cohorts.
