הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מחקר זה מציג פרוטוקולים לגידול שחלות עכברים לאחר הלידה על הכנסות ממברנה ולכימות זקיק שלם בשחלה שלמה. התוצאות הראו כי טיפול טכני במהלך תרבית שחלות משפיע משמעותית על ספירת הזקיקים הראשוניים, מה שמדגיש את החשיבות של שמירה על עקביות למזעור שונות לא-ביולוגית.
ביונקים, זקיקים פרימורדיאליים נוצרים במהלך התפתחות השחלות העוברית ומשמשים כמקור היחיד לשימור תפקוד השחלה של הבוגרים. המנגנונים העומדים בבסיס האופן שבו זקיקים פרימורדיאליים מתאספים, שומרים על תרדמה, מופעלים להתפתחות זקיקים ועוברים מוות תאי חשובים להבנת הפיזיולוגיה של השחלות ומצבים פתולוגיים. מחקר זה מציג פרוטוקול לגידול שחלות עכברים לאחר הלידה על הכנסות ממברנה, גישה המאפשרת תרבית וטיפול תרופתי בשחלות שלמות למשך עד 10 ימים, בהתאם לשלב ההתפתחות של השחלה. שינויים בתנאי התרבית יכולים להתבצע על ידי העברת תוספות המכילות שחלות מתורבתות בין בארות על צלחת, ובכך להימנע מהפרעה פיזית לרקמות במהלך התרבית. שחלות P5 בודדו וגודלו על תבנית בגודל 12 מ"מ בלוח עם 24 בארות, לדוגמה. כל שחלה הופרדה בתוך טיפה של מדיום DMEM/F12 שהושלמה עם 10% FBS, 3 מ"ג/מ"ל BSA, 10 mIU/mL FSH ואנטיביוטיקה-אנטימיקוטית, ויוצבה בעדינות על הכנסת הממברנה. המדיום שונה כל יומיים, והתרבות נשמרה במשך חמישה ימים בסך הכל. לאחר התרבית, השחלות תוקנו ב-4% פאראפורמלדהיד במשך שעתיים ועברו עיבוד לצביעת נוגדנים מלאה של סמן הביציות DDX4. הזקיקים הוסדרו וכמותו בהתבסס על גודל הביציות והמורפולוגיה הגרעינית של תאי זקיק סומטיים. התוצאות הראו שמספר הזקיקים הראשוניים בכל שחלה הושפע משמעותית מהמיקום הנכון של הרקמות על הכניסה לממברנה. בנוסף, הבדלים במספר השחלות בכל אינסרט עלולים להכניס וריאציות לא ביולוגיות ויש להימנע מהם.
אוגנזה היא תהליך מוסדר ומורכב מאוד שמוביל לייצור ביציות בוגרות. ביונקים, היווצרות מתחילה בשחלות עובריות, שם תאי נבט פרימורדיאליים (PGCs) מתמיינים לביציות ראשוניות. כל ביצית ראשונית מוקפת בשכבה של תאי פרה-גרנולוזה קשקשיים, היוצרים זקיק קדום. רוב הזקיקים הראשוניים הללו נכנסים לתרדמת לאחר היווצרות, ומשמשים כמאגר השחלות 1,2,3. בשחלה הבוגרת, הפעלה תקופתית של זקיקים פרימורדיאליים להתפתחות זקיקים, הידועה כפוליקולוגנזה, חיונית לשימור ייצור ביציות בוגרות והורמוני סטרואידים שחלתיים 4,5. בהיעדר ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
עכברים זכרים ונקבות CD-1 גודלו יחד ביחס של 1:1 כזוגות רבייה. תאריך הלידה של הגורים החדשים נקבע כיום 0 לאחר הלידה. כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית (IACUC) באוניברסיטת מיזורי (מספר פרוטוקול: 36647).
1. חומרים ומדיה תרבותית
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
במאמר זה אנו מדגים את שיטות תרבית השחלות התינוקות, צביעת נוגדנים שלמה, הדמיה קונפוקלית וכימות זקיקים כדי להעריך האם מספר ומיקום השחלות בהחדרה במהלך התרבית משפיעים על תוצאת הניסוי, ובפרט על ספירת הזקיקים בשחלה. תרבתנו שחלות עם ההגדרות הבאות: שחלה אחת, שתיים או שלוש לכל אינסרט לתרבית מיוצבת, ושלוש שחלות לכל אינסרט לתרבות צפה. השחלות גודלו בשני מצבים: קבוצת ביקורת או קבוצת טיפול תרופתי עם טיפול Dox של 24 שעות ב-0.1 מיקרוגרם/מ"ל. לאחר 24 שעות של תרבית, השחלות מקבוצת הביקורת והקבוצות שטופלו בדוקס הועברו למדיה חדשה של תרבית לע.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
במחקר זה הדגמנו שיטות לתרבות שחלות עכבר יילודה ולכימות זקיק השחלה השלם. גישת התרביות יכולה לשמר זקיקים פרימורדיאליים ומתפתחים מוקדמים במבחנה. שיטת הכימות של זקיקים בהרכב מלא דורשת עיבוד מינימלי של רקמות, מה שחוסך זמן ושומר על שלמות הרקמה ומבטיח כימות מדויק של הזקיקים.
מספר הזקיקים הראשוניים שנצפו בקבוצת הביקורת מצביע על כך שלמרות שיש ירידה קלה בהשוואה לספירות הזקיקים המדווחות בספרות בשחלות ביום 10 לאחר הלידה (כ-4,300 זקיקים לשחלה), התוצאות שלנו עדיין דומות
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
אין ניגודי עניינים שיש לחשוף.
המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכון הלאומי לבריאות תחת פרס מספר R35GM158131. EADM נתמכה על ידי קרן ללור. המחברים מודים בהכרת תודה ל-Advanced Light Microscopy Core של אוניברסיטת מיזורי על תמיכתם וסיועו בעבודה זו
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| לוחות תרבית תאים עם 24 בארות | פישר סיינטיפיק | 09-761-146 | |
| אלקסה פלואר 488 נגד ארנב לחמור | מעבדות מחקר חיסוני ג'קסון | 711-546-152 | |
| אנטי-אנטי (100X) | גיבקו | 15240-062 | |
| אלבומין סרום בקר | סיגמא-אלדריץ' | A1470-25G | |
| עכבר CD-1 IGS | מעבדות צ'ארלס ריבר | 022 | עכברים |
| הוספות לתרבות תאים | מיליפור | PICM01250 | |
| מזרק אינסולין Comfort Point עם מחט 1 סמ"ק 28G x 1/2 | אקסל | 26027 | |
| DAPI | תרמו-סיינטיפיק | 62248 | |
| MDX4 Rabbit mAb | אבקאם | ab13840 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) | גיבקו | 11320-033 | |
| דוקסורוביצין הידרוכלוריד | סיגמא-אלדריץ' | PHR1789 | |
| DPBS (1X) | גיבקו | 14190-144 | |
| סרום בקר עוברי | סיגמא-אלדריץ' | F0926-500ML | |
| Fiji-ImageJ | NIH, ארה"ב (https://imagej.net/ij/) | ImageJ 1.52p | |
| מיקסרי אגוז של פישרברנד - מהירות משתנה | פישר סיינטיפיק | 88-861-043 | שייקר |
| הורמון מגרה זקיקים | סיגמא-אלדריץ' | F4021-10UG | |
| פורמה סטרי-מחזור i160 | תרמו סיינטיפיק וטרייד; | i160 | חממת CO2 |
| גליצין | פישר סיינטיפיק | BP381-500 | |
| אימאריס | אוקספורד אינסטרומנטס (https://imaris.oxinst.com/) | אימאריס 10.2 | |
| לייקה TCS SP8 | לייקה מיקרוסיסטמס | SN 8100001409 | קונפוקלי |
| סרום חמור רגיל | מעבדות מחקר חיסוני ג'קסון | 017-000-121 | |
| אולימפוס SZ61 | מיקרוסקופים של אולימפוס | SZ61 | סטריאוסקופ |
| Paraformaldehyde | פישר סיינטיפיק | 15714 | |
| מרווח הדמיה SecureSeal | גרייס ביו-לאבס | 654002 | |
| טריטון X-100 | סיגמא-אלדריץ' | X100-500ML | |
| גיל 20 | סיגמא-אלדריץ' | P1379-500ML | |
| מדיום התקנת אנטיפייד VECTASHIELD | מעבדות וקטור | H-1000 |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.