Name: דימות סופר-רזולוציה של תא שלם באמצעות DNA-PAINT על דיסק מסתובב עם הקצאת פוטונים אופטית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: למדו מיקרוסקופיית לוקליזציה של מולקולה בודדת בעומק תאי באמצעות DNA-PAINT ודיסק מסתובב עם הקצאת פוטונים אופטית. שיטה זו מאפשרת דימות ברזולוציה גבוהה ללא אופטיקה מותאמת אישית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Lelek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Single-molecule localization microscopy.</a> Nat Rev Methods Primers. 1 (1), 39(2021).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nat Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li>
<li>Vignolini, T., Capitanio, M., Caldini, C., Gardini, L., Pavone, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+light+sheet+allows+volumetric+super-resolution+imaging+of+efflux+pumps+distribution+in+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly inclined light sheet allows volumetric super-resolution imaging of efflux pumps distribution in bacterial biofilms.</a> Sci Rep. 14 (1), 12902(2024).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oblique-plane+single-molecule+localization+microscopy+for+tissues+and+small+intact+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals.</a> Nat Methods. 16 (9), 853-857 (2019).</li>
<li>Ghosh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+molecular+interplay+of+CD20+and+therapeutic+antibodies+with+fast+volumetric+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Decoding the molecular interplay of CD20 and therapeutic antibodies with fast volumetric nanoscopy.</a> Science. 387 (6730), eadq4510(2025).</li>
<li>Wäldchen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Cell+imaging+of+plasma+membrane+receptors+by+3D+lattice+light-sheet+d+STORM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Whole-Cell imaging of plasma membrane receptors by 3D lattice light-sheet d STORM.</a> Nat Commun. 11 (1), 887(2020).</li>
<li>Zagato, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+devices+for+single+objective+single+plane+illumination+microscopy+%28SoSPIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+express%22%5BJournal%5D)">Microfabricated devices for single objective single plane illumination microscopy (SoSPIM).</a> Opt express. 25 (3), 1732-1745 (2017).</li>
<li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+high-and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">3D high-and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nat Methods. 12 (7), 641-644 (2015).</li>
<li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+J+%22Handbook+of+biological+confocal+microscopy%22">Handbook of biological confocal microscopy</a>. 236, Springer Science & Business Media. (2006).</li>
<li>Schueder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+3D+super-resolution+imaging+of+whole+cells+using+spinning+disk+confocal+microscopy+and+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Multiplexed 3D super-resolution imaging of whole cells using spinning disk confocal microscopy and DNA-PAINT.</a> Nat Commun. 8 (1), 2090(2017).</li>
<li>Azuma, T., Kei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+spinning-disk+confocal+microscopy+using+optical+photon+reassignment%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment.</a> Opt Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).</li>
<li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instant+super-resolution+imaging+in+live+cells+and+embryos+via+analog+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Instant super-resolution imaging in live cells and embryos via analog image processing.</a> Nat Methods. 10 (11), 1122-1126 (2013).</li>
<li>Zaza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+in+whole+cells+and+tissues+via+DNA-PAINT+on+a+spinning+disk+confocal+with+optical+photon+reassignment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging in whole cells and tissues via DNA-PAINT on a spinning disk confocal with optical photon reassignment.</a> Nat Commun. 16 (1), 4991(2025).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+kinetics+and+super-resolution+microscopy+by+fluorescence+imaging+of+transient+binding+on+DNA+origami%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Single-molecule kinetics and super-resolution microscopy by fluorescence imaging of transient binding on DNA origami.</a> Nano Lett. 10 (11), 4756-4761 (2010).</li>
<li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li>
<li>Thevathasan, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pores+as+versatile+reference+standards+for+quantitative+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super-resolution microscopy.</a> Nat Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+3D+cellular+super-resolution+imaging+with+DNA-PAINT+and+Exchange-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT.</a> Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
<li>Ober, R. J., Ram, S., Ward, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+accuracy+in+single-molecule+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Localization accuracy in single-molecule microscopy.</a> Biophys J. 86 (2), 1185-1200 (2004).</li>
<li>Tetley, R., Vaughan, A., Zaza, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTetley%2C+R+%22NIS-Elements+JOB+for+DNA-Paint+Acquisition+at+Serial+Z-Planes%22">NIS-Elements JOB for DNA-Paint Acquisition at Serial Z-Planes</a>. , (2025).</li>
<li>Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+estimate+the+average+localization+precision+of+a+single-molecule+localization+microscopy+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment.</a> Histochem Cell Biol. 141, 629-638 (2014).</li>
<li>Schlichthaerle, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+single+nuclear+pore+complex+proteins+using+genetically-encoded+probes+for+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of single nuclear pore complex proteins using genetically-encoded probes for DNA-PAINT.</a> Angew Chem. 131 (37), 13138-13142 (2019).</li>
<li>Stehr, F., Stein, J., Schueder, F., Schwille, P., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat-top+TIRF+illumination+boosts+DNA-PAINT+imaging+and+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Flat-top TIRF illumination boosts DNA-PAINT imaging and quantification.</a> Nat Commun. 10 (1), 1268(2019).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+super-resolution+imaging+with+qPAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative super-resolution imaging with qPAINT.</a> Nat Methods. 13 (5), 439-442 (2016).</li>
<li>Whelan, D. R., Bell, T. D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+artifacts+in+single+molecule+localization+microscopy%3A+why+optimization+of+sample+preparation+protocols+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters.</a> Sci Rep. 5 (1), 7924(2015).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+microtubule+ultrastructure+based+on+single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of microtubule ultrastructure based on single-molecule localization microscopy.</a> Cytoskeleton. , (2025).</li>
<li>Steen, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-PAINT+palette%3A+A+comprehensive+performance+analysis+of+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The DNA-PAINT palette: A comprehensive performance analysis of fluorescent dyes.</a> Nat Methods. 21 (9), 1755-1762 (2024).</li>
<li>Kessler, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-quenched+fluorophore-DNA+labels+for+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Self-quenched fluorophore-DNA labels for super-resolution fluorescence microscopy.</a> J Phys Chem B. 128 (28), 6751-6759 (2024).</li>
<li>Kessler, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-quenched+fluorophore+dimers+for+DNA-PAINT+and+STED+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Self-quenched fluorophore dimers for DNA-PAINT and STED Microscopy.</a> Angew Chem Int Ed. 62 (39), e202307538(2023).</li>
<li>Chung, K. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+DNA-PAINT+for+faster%2C+low-background+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic DNA-PAINT for faster, low-background super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 19 (5), 554-559 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>(&plusmn;)-6-הידרוקסי-2,5,7,8-טטרמתילכרומן-2-חומצה קרבוקסילית</td><td>מרק&nbsp;</td><td>238813-5G</td><td>טרולוקס</td></tr><tr><td>3,4-דיהידרוקסיבנזואיק חומצה &nbsp;</td><td>מרק&nbsp;</td><td>37580-25G-F</td><td>PCA</td></tr><tr><td>60& עדשת אובייקטיבית Apo NA 1.49</td><td>ניקון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עמודת הסרת מלח ספין 7.0 KDA המכילה שרף עם הוצאת גודל &nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק בע"מ</td><td>89882</td><td>עמודי דה-מלח Zeba Spin לשלב 2.4</td></tr><tr><td>אקוטאז - מדיום ניתוק תאי אנזים</td><td>תא קידום</td><td>C-41310</td><td></td></tr><tr><td>אלפקה sdAb (1H1) אנטי-GFP בשילוב עם DNA מותאם אישית (sdAB-5'-TCCTCCTCCTCCT-3')</td><td>פוטוניקה מסיבית</td><td>מוצר מותאם אישית</td><td>ננו-גוף אנטי-GFP עבור דרוזופילה</td></tr><tr><td>אלפקה sdAb (1H1) אנטי-GFP בשילוב עם DNA</td><td>פוטוניקה מסיבית</td><td>MASSIVE-TAG-Q-FAST אנטי-GFP - F3</td><td>גוף ננו-אנטי-GFP עבור NUP</td></tr><tr><td>טובולין אנטי-אלפא (YL1/2)</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>MA1-80017</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-ארנב IgG</td><td>פוטוניקה מסיבית</td><td>Massive-sdAB-FAST 2-Plex, sdAB משני F2</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-TCR&zeta; (6B10.2)</td><td>ביולג'נד</td><td>644102</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>מרק&nbsp;</td><td>A4503-10G</td><td>BSA</td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגלי קוני 15 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק בע"מ</td><td>17705004</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגלי חרוטי 50 מ"ל</td><td>VWR אינטרנשיונל</td><td>734-0448</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1 SoRa</td><td>ניקון</td><td></td><td>מיקרוסקופ SDC-OPR</td></tr><tr><td>הסרת מלח עמודות ספין עם Sephadex G-25 (שרף הוצאת גודל לטיהור DNA)&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק בע"מ</td><td>11743309</td><td>מותג: Cytiva. עמודות G-25 לשלב 2.5</td></tr><tr><td>D-גלוקוז</td><td>מרק&nbsp;</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>מדיה DMEM</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, אנהידרוס</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>DTT&nbsp; (דיתיותרייטול)</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>15976082</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>מרק</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>גלוטראלדהיד</td><td>סרבה</td><td>2311402</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>מרק&nbsp;</td><td>G5516-500ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>ביומדיקל MP</td><td>219482580</td><td></td></tr><tr><td>מאלימיד-PEG2-סוקסינימידיל&nbsp;</td><td>מרק&nbsp;</td><td>746223-50MG</td><td></td></tr><tr><td>מדיה 5A של מקוי</td><td>פישר סיינטיפיק בע"מ</td><td>16600082</td><td></td></tr><tr><td>MES (2-(N-מורפולינו)אתאנסולפוניק חומצה)</td><td>מרק</td><td>M3671-50G</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>פישר סיינטיפיק בע"מ</td><td>32213-25L</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>פישר סיינטיפיק בע"מ</td><td>10418464</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגות 0.5 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק בע"מ</td><td>11508232</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל</td><td>אפנדורף</td><td>10509691&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר מיקרוווליום UV-Vis</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>ND-ONE-W</td><td>ננודרופ</td></tr><tr><td>NaCl2</td><td>סיגמא-אלדריץ'</td><td>S6546-1L&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ננו-חלקיקים 90 ננומטר - זהב</td><td>ציטודיאגנוסטיקה</td><td>G-90-100</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת CMOS של Orca Fusion-BT</td><td>המאמאצו</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>15070063</td><td>P/S</td></tr><tr><td>תמיסה עם בופר פוספט (תמיסה 1x)</td><td>פישר סיינטיפיק בע"מ</td><td>11530546</td><td>PBS</td></tr><tr><td>פירס 16% פורמלדהיד (ללא מתנול), ללא מתנול</td><td>פישר סיינטיפיק בע"מ</td><td>11586711</td><td>PFA</td></tr><tr><td>כלוריד אשלגן &nbsp;</td><td>מרק&nbsp;</td><td>&nbsp; P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>פרוטוקטצ'ואט 3,4-דיאוקסיגנאז &nbsp;</td><td>מרק&nbsp;</td><td>P8279-25UN&nbsp;</td><td>PCD</td></tr><tr><td>Sodium&nbsp; הידרוקסיד</td><td>פישר סיינטיפיק בע"מ</td><td>12963614</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן TOM20</td><td>אבקאם</td><td>Ab186735</td><td></td></tr><tr><td>בופר טריס</td><td>VWR אינטרנשיונל</td><td>A4577.1000</td><td></td></tr><tr><td>טריטון&nbsp; X-100&nbsp; &nbsp;</td><td>VWR אינטרנשיונל</td><td>1086031000</td><td></td></tr><tr><td>טווין-20</td><td>מרק&nbsp;</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>יחידת סינון צנטריפוגלית אולטרסילטרציה, MWCO 100 קילו-דלטון</td><td>מרק&nbsp;</td><td>UFC510024</td><td>יצרן: אמיקון אולטרה</td></tr><tr><td>&mu;-Slide 8 באר גבוהה עם תחתית זכוכית גבוהה</td><td>איבידי</td><td>IB-80807</td><td></td></tr><tr><td>&mu;-Slide VI 0.5 תחתית זכוכית</td><td>איבידי</td><td>IB-80607</td><td></td></tr></tbody></table>

דימות סופר-רזולוציה של תא שלם באמצעות dna-paint על דיסק מסתובב עם הקצאת פוטונים אופטית

Whole-cell Super-Resolution Imaging via DNA-PAINT on a Spinning Disk Confocal with Optical Photon Reassignment

כדי להדגים את יכולות ההדמיה הסופר-רזולוציה של מערכת SDC-OPR (איור 1A), הוערכה רזולוציית המישור שלה באמצעות ביצוע ניסויי דימות DNA-PAINT (איור 1B) על קומפלקסים נקבוביים גרעיניים (NPCs), שהם מבנה ביולוגי ייחוס17. איור 1C מציג תמונה מייצגת של DNA-PAINT SDC-OPR של נוקלאופורין 96 (Nup96), המתויגת בחלבון פלואורסצנטי ירוק מונומרי משופר (mEGFPs) ומסומנת בננו-גופים אנטי-GFP מצומדים ב-DNA, בתאי U2OS. הפאנלים המוגדלים חושפים תת-מבנה של NUP, ואיור 1D מציג זוגות חלבוני Nup96 (מסומנים בחצים) התואמים את הסימטריה הצפויה של 8 פעמים של נקבוביות גרעיניות. באיור 1E, המרחק האוקלידי בין זוגות Nup96 נמדד על ידי יישור החתך ושרטוט ההיסטוגרמה החתך של התמונה המסוכמת (n = 16 זוגות). הניתוח חשף הפרדה בין שיאים של (13 ± 2) ננומטר (איור 1E), בהתאם לתוצאות ממודלים אלקטרומגנטיים וכן מהדמיית HILO ו-TIR23. כל התאמת שיא הציגה סטיית תקן של 4 ננומטר, מה שאישר את דיוק המיקום הגבוה (σSMLM = 3.3 ננומטר, NeNA = 4.4 ננומטר) שהושג באמצעות DNA-PAINT ב-SDC-OPR. ראוי לציין כי דיוק זה נשמר בכל שדה הראייה של 53 × 53 מיקרון רבוע, שהוא יוצא דופן למערכות מבוססות קונפוקלי.
כדי להדגים את היכולת להדמיה רב-צבעונית, Nup96, מיטוכונדריה ומיקרוטובולים בתאי U2OS סומנו ב-DNA לרכישה באמצעות Exchange-PAINT18. טכניקה זו עושה שימוש בחוטי צילום DNA אורתוגונליים המחוברים לפלואורופור יחיד, ומאפשרים לעורר את כל המטרות עם אותו מקור לייזר (איור 2A). במקום לקבל אותות בו-זמנית, הוא מפריד אותם בין סבבי הדמיה עוקבים, ומאפשר אינטגרציה פשוטה בכל מערכת SDC-OPR מסחרית. איור 2B מציג את Nup96 בכחול מסומן בננוגוף אנטי-GFP, מיטוכונדריה באדום עם נוגדן אנטי-TOM20 משני, ומיקרוטובולים בירוק עם נוגדן אנטי-α-טובולין ראשוני. ראוי לציין כי דיוק המיקום המולקולי היחיד היוצא דופן שהושג עבור הדמיית Nup96 בצבע יחיד נשמר על פני כל המטרות בניסוי רב-מטרות, והניב ערכי דיוק מיקום של 3.9 ננומטר ל-NPC, 4.0 ננומטר ל-α-טובולין, ו-3.3 ננומטר למיטוכונדריה (איור 2B לוחות 1, 2 ו-3).
להדמיית שדה ראייה גדול, מיקרוטובולים בתאי HeLa צולמו באמצעות הגדלות שונות הזמינות במערכת SDC-OPR, בשילוב עם הגדרות שונות של המצלמה לשמירת גודל פיקסלים בין 78 ל-108 ננומטר (איור 3). איור 3A מציג את שלד הציטובולים של 10 תאי HeLa, כאשר צבעים מייצגים דיוק לוקליזציה. בהגדלה של 1×, דיוק המיקום הממוצע נמוך יותר באופן ניכר לעומת הגדלות גבוהות יותר (איור 3B-D), כאשר נצפתה שונות גבוהה יותר. הסיבה לכך היא ירידה בצפיפות ההספק של הלייזר בשדה הראייה הגדול יותר, שם פרופיל האור הגאוסי מתגלה, מה שמוביל לירידה בדיוק בקצוות שדה הראייה. עם זאת, השגת דיוק מיקום ממוצע של 9.5 ננומטר בשדה ראייה רחב של 211 × 211 מיקרומ² מרשימה למערכות מבוססות קונפוקליות ומאפשרת חקירה ברזולוציה גבוהה של הטרוגניות ביולוגית.
לבסוף, האפשרות להדמות תאים שלמים מודגמת על ידי רכישת תמונות DNA-PAINT של רשת המיקרוטובולים בתאי HeLa קבועים בנפח קונפוקלי של ~500 ננומטר ו-1 מיקרומטר z-step באמצעות ההגדלה הגבוהה ביותר של המערכת (4×, 53 ×-53 מיקרומטר²). איור 4A מציג את תמונות השחזור של מולקולה בודדת עבור כל מישור z, יחד עם דיוק הלוקליזציה וערכי NeNA המתאימים. בנוסף, הדמיה צבעונית תלת-ממדית של רשת המיקרוטובולים בתא HeLa מסופקת באיור 4C. ככל שהעומק עולה, מספר הפוטונים המזוהים פוחת עקב פיזור וסטיות אופטיות, מה שמוביל לירידה בדיוק המיקום הן לדיוקי המיקום הנגזרים מ-Cramér-Rao Lower Front Limit (CRLB) (איור 4A, מימין) וגם לאלו המחושבים באמצעות מדד NeNA. עם זאת, רמת איסוף הפוטונים הגבוהה האפשרית על ידי מערכת SDC-OPR מאפשרת σSMLM ≤ 10 ננומטר לעומק הדמיה של עד 9 מיקרון עם התפלגויות צרות. למעשה, מבני מיקרוטובולים חוטיים דו-דפנתיים היו ברורים בעומקים שונים: ליד ממשק תא כיסוי-תא, במיקומים ציריים ביניים, ובראש התא, עם מרחק שיא לשיא בין 30 ננומטר ל-40 ננומטר (איור 4C), בהתאם לערכים המדווחים24. תוצאות אלו מדגישות את יכולתו של SDC-OPR לספק הדמיה ברזולוציה גבוהה על פני שדה ראייה גדול ובכל גובה התאים.
<img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
איור 1: מיקרוסקופ לוקליזציה חד-מולקולית במישור של דגימות תאים שונות והדמיה ברזולוציה על-צבעונית רב-צבעונית. (א) סכמטיקה של מערכת הקונפוקל דיסק המסתובב עם הקצאת פוטונים אופטית (SDC-OPR), הכוללת מערך מיקרועדשות שנועד למקסם את איסוף הפוטונים. (B) סכמטי של DNA-PAINT: גדילי DNA מסומנים פלואורסצנטית, הידועים כגדילי מצלמים, היברידים באופן זמני עם רצפי DNA משלימים (גדילי עגינה) המעוגנים בנוגדן/ננו-גוף המכוון לחלבון המעוניין. אירועי קישור קצרי מועד אלו יוצרים אותות פלואורסצנציה הנראים כהבהוב סטוכסטי. (ג) תמונת DNA-PAINT מייצגת על מערכת SDC-OPR באמצעות הגדלה של 4× של NPC של תאי U2OS. יכולת הרזולוציה הגבוהה מודגמת במערכת הפנימית, שבה NPCים בודדים מפורטים בבירור. (D) DNA-PAINT משופר על ידי SDC-OPR מאפשר המחשה של NPCs בודדים, כאשר חצים לבנים מדגישים זוגות חלבונים אופייניים של Nup96 בתוך ארכיטקטורת הנקבוביות. (ה) התפלגות מדידות המרחק בין דימרים של Nup96 (n=16 זוגות) בתוך יחידות סימטריה NPC בודדות. איור זה שונה מ-Zaza ואחרים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.</a> 
<img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
איור 2: Exchange-PAINT להדמיה רב-צבעונית באמצעות מיקרוסקופ SDC-OPR. (א) סכמטי של Exchange-PAINT של שלוש מטרות שצולמו ברצף. שלושה יעדי חלבון סומנו בנוגדנים פונקציונליים ב-DNA, קטעי Fab או ננו-גופים. חוטי המצלמה של Cy3B צולמו ברצף לפי סוג הגדיל עם שלבי שטיפה בין סבבי ההדמיה. (B) הדמיית Exchange-PAINT בשלושה צבעים של תאי U2OS באמצעות מיקרוסקופ SDC-OPR עם הגדלה של 4×, המראה מיקרוטובולים (אדום; מסומנים באנטי-α-טובולין מצומד ב-DNA), מיטוכונדריה (ירוק; TOM20 שמכוון לננו-גופים DNA), ו-NPC (כחול; Nup96 עם תווית mEGFP עם ננו-גופים נגד GFP). מוט סולם: 5 מיקרון. אזור המוגדל מדגיש את הרזולוציה המשופרת שהושגה במערכת SDC-OPR, תוך התמקדות ב-(1) מיטוכונדריה, (2) מיקרוטובולים ו-(3) NUP. פסי קנה מידה = 1 מיקרון. איור זה שונה מ-Zaza ואחרים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.</a>
<img alt="איור 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
איור 3: הדמיית DNA-PAINT בתוך שדה ראייה גדול במיקרוסקופ SDC-OPR. תמונות מיקרוטובול DNA-PAINT (תיוג אנטי-α-טובולין) שנרכשו בהגדלות מרובות: (A) 1× הגדלה ו-1 binning (שדה ראייה של 211 × 211 מיקרומטר²), (B) 2.8× ו-2 binning (שדה ראייה 76 × 76 מיקרומטר²), (C) הגדלה 4× ו-4 binning (שדה ראייה של 53 × 53 מיקרומ²). הצבע מייצג את דיוק הלוקליזציה מ-0 ל-16 ננומטר במקרה של הגדלה פי 1 ובין 0 ל-4 ננומטר באחרים. (D) דיוק מיקום שנמדד במרחקים שונים (במיקרומטר) ממרכז שדה הראייה להגדלות של 1× (אדום), 2.8× (צהוב) ו-4× (ירוק). איור זה שונה מ-Zaza ואחרים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.</a>
<img alt="איור 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
איור 4: הדמיית DNA-PAINT של תא שלם. (א) שמאלה. הדמיית מיקרוטובולים נפחית בתאי HeLa באמצעות DNA-PAINT שנרכשה באמצעות SDC-OPR בהגדלה של 4×, ומציגה חתכים ציריים מ-z = 0 עד 9 מיקרון (שלבים של 1 מיקרומטר). כל מישור מציג מיקום z , דיוק לוקליזציה ומדד NeNA. פסי קשקש: 5 מיקרון (xy). נכון. דיוק לוקליזציה לעומת עומק חדירה לכל המישורים. (B) הדמיה תלת-ממדית של רשת המיקרוטובולים על אותו תא HeLa כמו ב-(A). הצבע מייצג עומק חדירה מ-0 עד 9 מיקרון. (C) תמונות מוגדלות של אזורים קטנים מודגשים מכל עומק חדירה המסומן ב-(A). איור זה שונה מ-Zaza ואחרים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.</a>

דימות סופר-רזולוציה של תא שלם באמצעות DNA-PAINT על דיסק מסתובב עם הקצאת פוטונים אופטית

Single-molecule localization microscopy (SMLM) enables nanoscale imaging of cellular structures but is typically restricted to imaging near the coverslip ...

הפרוטוקול שלנו משתמש ב-DNA-PAINT על מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב עם הקצאת פוטונים אופטית כדי להתגבר על מגבלות עומק. DNA-PAINT משיג כיום רמת רזולוציה גבוהה מאוד עם מולטי-פלקסים ויכולות כמותיות, ועוקף טכניקות SMLM אחרות כמו PALM ו-STORM. כדי להתחיל, השתמש במערכת קונפוקלית דיסק מסתובב המצוידת ביחידת הקצאת פוטונים אופטית ובמצלמת sCMOS.הפעל את המערכת 30 דקות לפני ההדמיה על ידי הפעלת המיקרוסקופ, המצלמה והלייזרים. ואז תפעיל את המחשב. חכה שתוכנת NIS-Elements תיטען במלואה.כעת, בחר את מצב ההדמיה המתאים ב-NIS-Elements על ידי בחירת SoRa Spinning Disk לפני הגדרת פרמטרי רכישה. בחרו במטרה לטבילה בשמן עם צמצם נומרי של 60x Apo 1.49 כדי למקסם את גילוי אירועי מולקולה בודדת. לאחר מכן, בחר את ההגדלה המתאימה לפי המטרה, הגדרות המצלמה והדגימה.כוון את כיפוף המצלמה בהתאם כדי להתאים להגדלה שנבחרה. קבע את זמן החשיפה לרכישת DNA-PAINT. כעת, הגדר את אורך הגל של הלייזר, עוצמת הלייזר וגלגל הסינון בהתאם לספקטרום הצבע של המצלמת.כדי להקליט את עוצמת הלייזר לאחר המטרה, הניחו חיישן מד עוצמת לייזר מכויל על שלב המיקרוסקופ ליד מישור הדגימה ורשמו את ההספק הנמדד. לאחר מכן, מרח טיפה של שמן טבילה על המטרה הנקייה של 60x Apo עם פתח נומרי 1.49. אבטח את דגימת התאים המוכנה עם צביעה חיסונית על שלב המיקרוסקופ באמצעות מתאם שלב כדי למזער סחף.עבור למצב שדה בהיר והתמקד במישור הזכוכית באמצעות ננו-חלקיקים כהפניה. לאחר מכן הפעל את מערכת Perfect Focus כדי לשמור על ריכוז במהלך הרכישה. כאשר מערכת המיקוד המושלם פעילה, שנו זמנית את העירור לתעלה החלבונית הפלואורסצנטית הירוקה כדי לזהות את מישור המוקד האופטימלי.השתמש בעוצמת לייזר נמוכה בשלב זה. הגדר את שם הניסוי ונתיב השמירה. סמן את תיבת הזמן כדי להגדיר את המרווח, משך הזמן ומספר הלולאות.הגדר את המרווח ל-No Delay והזן את מספר הלולאות המתאים למספר הכולל של הפריימים. ודא שתיבת ה-PFS בתחתית נבחרה. חזרו להגדרות ההתרגשות שהוגדרו קודם לכן ב-SoRa ולחצו על Run Now.להשיג 15,000 עד 20,000 פריימים לחלבון הראשון, תוך שימוש בזמן אינטגרציה של 300 מילישניות. לניתוח תמונה, טען את ערימת התמונה המפורקת למודול המקומי של פיקאסו. בחר 'ניתוח' ואז 'פרמטרים' מהתפריט והזן את הפרמטרים הספציפיים למצלמה בהתאם למפרט היצרן.לאחר מכן, הגדר את אורך צד הקופסה לשבע כדי למקסם דיוק מיקום של מולקולה בודדת. בחר ערך גרדיאנט נטו מינימלי מתאים ואפשר תצוגה מקדימה להצגת לוקליזציות שזוהו. כוון את סף הגרדיאנט כדי למזער גילויי רקע.עכשיו, בחר ב-Analyze ואז Localize כדי להתחיל בזיהוי נקודות והתאמה לכל הפריימים. טען את ה-hdf5 שנוצר למודול Picasso Render כדי להמחיש את מפת הלוקליזציה המשוחזרת. בחר ב-Postprocess ואז ב-Undrift by RCC.הזן ערך סגמנטציה התחלתי שמתחיל ב-1,000 כדי לקבל גרף דריפט xy. חזור על זה עם ערכי סגמנטציה נמוכים יותר כדי לשפר את תיקון הסטייה. לחץ על קובץ ושמור לוקליזציה כדי לשמור את קובץ הלוקליזציה שתוקן בדריפט לפני סגירת מודול הרינדור.כעת, טען את הקובץ המתוקן בדריפט למודול פילטר פיקאסו והחלו ספים המבוססים על דיוק לוקליזציה, רוחב פונקציית פיזור נקודתי, ספירת פוטונים ומדדי איכות נוספים. לחץ על קובץ ושמור לוקליזציה כדי לשמור את קובץ הלוקליזציה המסונן לפני סגירת מודול הסינון. הדמיית DNA-PAINT של נוקלאופורין 96 שסומנה עם חלבון פלואורסצנטי ירוק מונומרי משופר בתאי U2OS יצרה דפוס ברור וסופר-רזולוציה של קומפלקס נקבובית גרעינית בשדה הראייה.תצוגות מוגדלתות חשפו תת-יחידות זוגיות של נוקלאופורין 96 מסודרות בסימטריה השמונה הצפויה של נקבוביות גרעיניות. מדידת המרחק האוקלידי בין זוגות נוקלאופורין 96 מיושרים הראתה הפרדה בין שיא לשיא של 13 פלוס או מינוס 2 ננומטרים. נוקלאופורין 96, מיטוכונדריה ומיקרוטובולים הוצגו בו-זמנית בתאי U2OS עם דיוק מקומי של מולקולה בודדת בכל המטרות.שדה ראייה רחב הדמיית מיקרוטובולים בתאי HeLa הראתה כי דיוק המיקום משתנה בהתאם להגדלה וגודל השדה, עם דיוק מופחת שנצפה בהגדלה נמוכה יותר. הגדלות גבוהות יותר הניבו דיוק מיקום משופר ואחיד יותר בהשוואה להגדלה פי 1. הדמיה של תא שלם הודגמה על ידי רכישת רשת המיקרוטובולים על ידי DNA-PAINT על פני מישורים ציריים מרובים המשתרעים על פני כל עומק התא.דיוק הלוקליזציה ירד בהדרגה עם עומק ההדמיה. מבני מיקרוטובול דו-קיריים נפתרו במיקומים ציריים מרובים עם מרחקים בין שיא לשיאים בין 30 ננומטר ל-40 ננומטרים. הפרוטוקול שלנו משיג הדמיית DNA-PAINT של תאים ורקמות עמוקות מבלי לוותר על רזולוציה, באמצעות אופטיקה פשוטה וזמינה מסחרית.DNA-PAINT ברזולוציה גבוהה פועלת בעיקר תחת TIRF או תאורה גבוהה, ומגבילה עומק דימות לכמה מיקרונים בלבד. הממצאים שלנו הופכים את DNA-PAINT לנגיש למעבדות רבות, ומאפשרים הדמיה בקנה מידה ננומטרי בתאים וברקמות בעומק.

whole-cell-super-resolution-imaging-via-dna-paint-on-spinning-disk

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים רזולוצית סופר שיטת הדמיה כדי לבחון את המבנה הארגוני של FtsZ טבעת החיידקים, מנגנון חיוני לחלוקת תא. שיטה זו מבוססת על ניתוחים כמותיים של מיקרוסקופיה תמונות לוקליזציה photoactivated (PALM) ויכולה להיות מיושמת על חלבוני cytoskeletal חיידקים אחרים.

הדמית סופר רזולוציה של מכונות אגף קטריאלי

אנו מתארים כיצד ליישם מיקרוסקופיה לוקליזציה photoactivated (PALM) מבוסס מחקרים של שלפוחית ​​בנוירונים קבוע, בתרבית. רכיבי מפתח של הפרוטוקול שלנו כוללים שלפוחית ​​תיוג עם מפלצות photoconvertible, איסוף תמונות גולמיות נדגמו בדלילות עם מערכת מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר, ועיבוד התמונות גולמיות כדי לייצר תמונה ברזולוציה סופר.

הדמיה ברזולוציה סופר של שלפוחית ​​צפופות ליבות עצבית

מידע מרחבי-זמני על חלבונים דינמיים בתוך תאים חיים הוא חיוני להבנת הביולוגיה. סוג של מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה הנקראת מיקרוסקופ תאורה תלת-ממדי מהיר (f3D-SIM) חושף מידע ייחודי על טבעת Z הציטוקינטית בחיידקים: הן המראה דמוי החרוז והן הדינמיקה המהירה של FtsZ בתוך הטבעת.

הדמיה ברזולוציה סופר של Cytokinetic Z הטבעת בחיידקים חיים באמצעות-Structured 3D מהיר תאורה מיקרוסקופית (f3D-SIM)

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הדרושים כדי להשיג תוצאות לוקליזציה חלבון subcellular על דג זברה הרשתית על ידי התאמת מיקרוסקופ אור סופר רזולוציה וסריקת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים.

רזולוציה סופר correlative ואלקטרון לפתרון חלבון לוקליזציה ברשתית דג זברה

מאמר זה מתאר פרוטוקול איתור של אחד או יותר פלזמה ו/או חלבונים תאיים ממברנה בעזרת מיקרוסקופ סופר-ברזולוציה המחסור בקרקע (GSD) בתאי יונקים. כאן, אנו נדון את היתרונות ואת השיקולים של שימוש בגישות כאלה עבור ויזואליזציה של כימות של החלבונים.

הדמיה סופר-ברזולוציה המחסור בקרקע בתאים בתרבית

פרוטוקול זה מסביר כיצד להכין ולטעון דגימות חיידקיים עבור הדמיה תלת ממדית חיה וכיצד לשחזר את הצורה תלת ממדית של E. coli מתמונות אלה.

הדמיה תלת ממדית של תאים חיידקיים לייצוגים סלולריים מדויקים ולוקליזציה של חלבון מדויק

מוצג כאן פרוטוקול להדמיית תאים חיים ברזולוציית-על ברקמה שלמה. התקנו את התנאים להדמיית אוכלוסיית תאי גזע בוגרים רגישים מאוד בסביבת הרקמה הטבעית שלה. טכניקה זו כרוכה באיזון רזולוציה זמנית ומרחבית כדי לאפשר תצפית ישירה של תופעות ביולוגיות ברקמה חיה.

הדמיית תאים חיים ברזולוציה סופר-רזולוציה של מבנים תת-תאיים

קרום המרתף חיוני למורפוגנזה של רקמות ואיברים במהלך ההתפתחות. כדי להבין טוב יותר את המנגנונים המובילים למיקום נכון של מבנה זה, הפרוטוקול שהוצג מתאר שיטות להמחשה ואפיון של הסחר התוך-תאי וההפרשה של חלבוני קרום המרתף בתאי אפיתל באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה.

הדמיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה של סחר תוך-תאי מקוטב והפרשת חלבוני ממברנת מרתף במהלך Drosophila Oogenesis

מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה יכולה לספק תובנה מפורטת על ארגון הרכיבים בתוך קומפלקס סינפטונמלי במיוזיס. כאן אנו מדגימים פרוטוקול לפתרון חלבונים בודדים של קומפלקס סינפטונמלי Caenorhabditis elegans .

מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה במיוחד של קומפלקס סינפטונמלי בתוך נבט Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה מפרט את יישומי ההדמיה המתקדמים ואת ניהול המשאבים המשותפים של מערכת מיקרוסקופ קונפוקלי סורקת לייזר, המשולבת עם גלאי מערך מרובה לעיבוד ברזולוציה גבוהה להדמיה תאית ותת-תאית ברזולוציה גבוהה. תהליך העבודה מאפשר הדמיה מולטימודלית מקונפוקלי לרזולוציה סופר (~120 ננומטר) בתוך פלטפורמה אחת, מה שמקל על הדמיה בקנה מידה ננומטר.

דימות ברזולוציה גבוהה וניהול משותף: פרוטוקול למיקרוסקופיה קונפוקלית עם זיהוי מולטיפלקס

למדו מיקרוסקופיית לוקליזציה של מולקולה בודדת בעומק תאי באמצעות DNA-PAINT ודיסק מסתובב עם הקצאת פוטונים אופטית. שיטה זו מאפשרת דימות ברזולוציה גבוהה ללא אופטיקה מותאמת אישית.

דימות סופר-רזולוציה של תא שלם באמצעות DNA-PAINT על דיסק מסתובב עם הקצאת פוטונים אופטית

גלה סרטונים נוספים