טיהור של טרופובלסטים HLA-G+ אקסטרווילוס מרקמות שליה במונחים אנושיים לצורך פנוטיפינג וניתוח תפקודי
13 במרץ 2026
פרוטוקול זה מאפשר טיהור, אפיון ותרבות של טרופובלסטים ראשוניים מסוג HLA-G+ אקסטרווילוס (EVT) מהדצידואה בזליס ומהקרום הכוריוני של שליות המונחים האנושיים. תרביות EVT ראשוניות שומרות על חיוניות למשך 96 שעות, ומאפשרות קו-קלטור עם תאי חיסון אימהיים תואמים לדגימה וניתוח זרימה ציטומטרי ומולקולרי של האינטראקציות ביניהן.
פרוטוקול זה נועד לטהר טרופובלסטים ראשוניים של בני אדם מרקמות שליה כדי לחקור את תכונותיהם התפקודיות ואת התכונות החיסוניות שלהם בהריון בריא ובתנאים פתולוגיים. לכן פרוטוקול זה מספק פלטפורמה ניתנת לשחזור כדי להתגבר על מגבלות קודמות בעבודה עם טרופובלסטים אנושיים ראשוניים, כלומר החיוניות שלהם. אז הפרוטוקול הזה מותאם מאוד כדי לשפר את הקיימות והטוהר שלהם.
כדי להתחיל, קבל דגימת שליה אנושית. הניחו את השליה כשהצד העוברי פונה כלפי מעלה כך שמקום הכנסת החבל יהיה גלוי. קילפו ידנית את האמניון מהממברנה הצידית לכיוון אתר החדרת חבל הטבור והסירו אותו.
אחר כך השתמש במספריים כדי לחתוך ולהשליך את האמניון. חתוך את הממברנה הכורידית לרצועות של שני אינץ' שמתחילים מבסיס השליה כלפי מעלה, תוך שמירה על כל רצועה מחוברת לשליה. מניחים את רצועת הממברנה הכורידית על פני שתי אצבעות, כאשר הצד הנשיר פונה כלפי מעלה.
בעזרת זוג מלקחיים סטריליים ומעוקלים, יש לגרד בעדינות את הדצידואה פרייטליס מהאם מהכוריום. אסוף את דצידואה פריאטליס לתוך צינור חרוטי בגודל 50 מיליליטר המכיל 20 מיליליטר PBS לצורך בידוד לימפוציטים. לאחר מכן אספו את הממברנה הכירונית לצינור חרוטי נפרד בנפח 50 מיליליטר המכיל 20 מיליליטר של מדיום שטיפה A. באמצעות מספריים, חתוך את הממברנה הכירונית בתוך צינור ה-50 מיליליטר לחתיכות קטנות משני מילימטרים רבועים.
זרוק את הכביסה המדיום A מהצינור. שטפו את הרקמה שוב ושוב עם PBS עד שהסופרנטנט מתבהר. לפירוק שליה, מניחים את השליה כאשר צד האם פונה כלפי מעלה והסירו קרישי דם.
באמצעות מספריים סטריליים, חתכו חתיכות של פלטת השליה הבסיסית תוך הימנעות מאזורים נקרוטיים, מסוידים או איסכמיים. מניחים את חתיכת הדצידואה בזליס על האצבעות כשהווילי פונה כלפי מעלה. לאחר מכן השתמשו במספריים כדי להסיר בזהירות את הווילי ולקבל ממברנה של שניים עד שלושה מילימטרים, כאשר נותרה רק שכבת ווילוס דקה.
אסוף את רקמת הדצידואה בזליס לתוך צינור קוני בגודל 50 מיליליטר המכיל 20 מיליליטר PBS. לאחר מכן חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות משני מילימטרים רבועים. לאחר מכן, השליכו את ה-PBS מהצינור.
שטוף את הדצידואה בזליס שוב ושוב עם PBS עד שהסופרנטנט נקי ללא דם נראה לעין. לאחר מכן פיצל 15 מיליליטר של תליית רקמה לשני צינורות חרוטיים של 50 מיליליטרים. מלא את כל הצינורות ב-PBS.
צנטריפוגות את הצינורות ב-200G לדקה אחת ושפכו את הסופרנטנט. הוסיפו 150 מיליליטר של קוקטייל אנזימי עיכול חם לרקמות חמות לבקבוק זכוכית בנפח 300 מיליליטר. הוסף 30 מיליליטר של ממברנה כורית לבקבוק.
הוסף 20 מיליליטר DMEM/F-20 חם וקוקטייל אנזימי עיכול חם של 80 מיליליטר לשני בקבוקי זכוכית נפרדים בנפח 300 מיליליטר. לאחר מכן הוסיפו 7.5 מיליליטר דצידואה בזאליס לכל בקבוק. דגרו את הבקבוקים באמבט מים.
נער את כל הבקבוקים כל שלוש עד ארבע דקות במהלך הדגירה של 15 דקות. לאחר העיכול, סנן את הרקמה דרך מסנני מתכת בגודל רשת של 40. לאחר מכן הוסיפו חומר כביסה מדיום B לשטיפה של רקמות ולהמיס חומר ג'לטיני.
העבר את הרקמה הלא מעוכלת חזרה לבקבוקי הזכוכית וחזור על העיכול. לאחר מכן מסננים את מתלי התא דרך פילטר של 100 מיקרומטר לצינורות חרוטיים מסומנים בנפח 50 מיליליטר. שמור על תאים מהעיכול הראשון והשני מופרדים.
אחר כך צנטריפוגה את המתלה של התא ב-650G למשך שמונה דקות. זרוק את הסופרנטנט. שלבו כדורים מאותו סוג רקמה ומספר עיכול לתוך צינור אחד.
אחר כך תשלים את הנפח עם שטיפה בינונית B עד 25 מיליליטר. הוסף 12 מיליליטר פיקול לארבעה צינורות חרוטיים של 50 מיליליטר המסומנים בסוג הרקמה ומספר העיכול. בזהירות שכבת תליית התא על הפיקול.
ואז צנטריפוגה ב-800 גרם למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בלי לשבור. שאפו בזהירות את שכבת התא בממשק מדיום הפיקול והעבירו אותה לצינורות מסומנים ונקיים. לאחר מכן מלא את הצינורות ב-Medium B, צנטריפוגה ב-650G למשך שמונה דקות, ותשהה מחדש את הכדורים.
הניחו את הכדורים התלויים בצינורות מיון תאים סטריליים המופעלים על ידי פלואורסצנציה, המסומנים בסוג הרקמה ומספר העיכול. הוסיפו נוגדנים נגד CD45 BV785, אנטי-HLA GAPC, ואנטי-EGFR1 BV711. דגרו במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
לאחר שטיפה והשעיית התאים במדיום כביסה B, העבירו מיד דרך מסננת תאים בגודל 40 מיקרומטר. מיין CD45 שלילי HLAG חיובי EGFR חיובי אקסטרווילוס טרופובלסט לצינורות המכילים תווך תרבית EVT של מיליליטר אחד A. ניתוח ציטומטריית זרימה של סמני שושלת הראה תרבית טרופובלסט ראשונית אקסטרווילוס בת קיימא עד היום הרביעי. תמונות מיקרוסקופיות אור מייצגות של טרופובלסטים אקסטרווילוס חיוביים עם HLAG עם קריון ראשוני ודצידואה בסאליס (decidua basalis) צולמו לאחר 24 שעות, 48 שעות ו-72 שעות של תרבית.
טרופובלסט אקסטרווילוס ביטא מולקולות HLAC פולימורפיות ומולקולות קו-איניביטיביות מדכאות חיסון. טרופובלסט אקסטרווילוס העלה את הביטוי של HLAC, PD-L1, PD-L2 ו-HLA-E, אך לא הגביר את הביטוי של PVR ו-B7H3 בעת תרבית משותפת עם לימפוציטים פעילים במשך 72 שעות. לא נצפתה עלייה במוות טרופובלסטים אקסטרווילוס לאחר חקלאות משותפת עם לימפוציטים פעילים.
אז פרוטוקול זה מאפשר לאנשים, מדענים, להשתמש בטרופובלסטים ראשוניים אקסטרווילוס למגוון רחב של בדיקות. היתרון הוא הכדאיות הגבוהה שמאפשרת ניתוח באמצעות תרבית תאים, תרבית קרה, ציטומטריית זרימה, פרוטאומיקה, טרנסקריפטומיקה, תוך שימוש בטרופובלסטים בעלי תפוקה גבוהה ויעילים במיוחד. אז אחד ההיבטים החשובים ביותר בפרוטוקול שלנו הוא שצריך להשתמש בחומרים טריים של השליה.
אי אפשר לקרר אותם. טרופובלסטים אוהבים למות, לכן אנא קבלו את רקמות השליה בהקדם לאחר הלידה, רצוי תוך שעתיים לאחר הלידה, ושמרו אותן בטמפרטורת החדר בכל עת. זה קריטי לקבלת טרופובלסט אקסטרווילוס יעיל במיוחד.
אז חלק מהשיטות הנוספות והחדשניות שאפשר להשתמש בטרופובלסטים הראשוניים הללו הן תרבית תאים לטווח ארוך. אז אפשר להשתמש בהם כדי לקבוע תרביות תאים ראשוניות לארבעה ימים. אז תאים יהיו חיים עד 96 שעות, שזה די ארוך ומאפשר לבצע תרביות קור עם תאי חיסון, כמו תאי T ותאי NK.
החידוש הנוסף הוא שאפשר להשתמש בהם כדי להקים קווי תאים דמויי טרופובלסטים בשיטות שתוארו לראשונה על ידי אוקי, ושהשתמשנו בהם גם על תרביות אלו כדי לבסס סוגי תאים מתרבים לטווח ארוך שניתן להשתמש בהם לעריכת גנום ובדיקות תרביות ארוכות טווח נוספות. אז שימוש בשיטות החדשניות האלה, כולל תרבית תאים ארוכת טווח, אני חושב שזה יכול לעזור לך לעצב תרביות מכניות ארוכות טווח שבהן אפשר ליישם עריכת גנום, גני נוק-אאוט, חלבונים, ביטוי יתר על המידה של חלק מהטרופובלסטים האלה כדי לקבל הרבה יותר פרטים מכניים על איך הטרופובלסטים האלה מחזקים סבילות, או לאפשר חיסון ויותר ציטוטוקסיות כשהן באינטראקציה עם אוכלוסיות חיסוניות.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לבבידוד ואפיון של טרופובלסטים חוץ-ווילואים (EVT) ראשוניים מבני אדם מרקמות של שליה. המתודולוגיה מאפשרת לחוקרים ללמוד את האינטראקציות האימונולוגיות הייחודיות בממשק העוברי-אימהי, עם יישומים הן בהריונות תקינים והן בהריונות פתולוגיים, כגון רעלת הריון ולידה מוקדמת.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה של הרבייה
- ביולוגיה של השיליה
- בידוד ואפיון של תאים
רקע
- הממשק העוברי-מטריסיי (maternal-fetal interface) הוא סביבה אימונולוגית ייחודית הדורשת סבילות חיסונית.
- תאי EVT מביעים מולקולות טולרוגניות (HLA-G, PD-L1, PD-L2) הממתנות את התגובות החיסוניות של האם.
- תאי EVT אנושיים מביעים גם HLA-C, המקיים אינטראקציה עם תאי T ותאי NK של האם.
- במודלים של בעלי חיים חסרים אורתולוגים למולקולות מפתח של EVT אנושי, דבר המחייב מחקר ישיר של רקמות אנושיות.
מטרת המחקר
- אספקת פרוטוקול חסון לבידוד ואפיון של EVT אנושי ראשוני מרקמות שליה.
- מתן אפשרות לחקירת תכונות ה-EVT הן בתנאים פיזיולוגיים והן בתנאים פתולוגיים.
- סיוע למחקר על מנגנוני שימור ההיריון ודלקת השליה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דיסקציה של רקמות שליה וקרומי כוריון.
- עיכול אנזימטי והכנת תרחיפי תאים בודדים.
- טיהור של EVT באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS).
- אפיון פנוטיפי באמצעות ציטומטריית זרימה רב-ממדית.
- תרבית in vitro לטווח קצר ותרבית משותפת עם תאי מערכת החיסון של האם (עד 96 שעות).
תוצאות עיקריות
- ביסוס של פרוטוקול הניתן לשחזור להשגת EVT בטוהר גבוה ובחיוניות גבוהה.
- EVT המתאימה ליישומים המשכיים כגון בדיקות אימונולוגיות ואנליזה של ביטוי גנים/חלבונים.
- פלטפורמה המאפשרת מחקר של אינטראקציות בין EVT לתאי מערכת החיסון האימהית, הן בהריונות תקינים והן בהריונות מורכבים.
מסקנות
- הפרוטוקול מקדם את חקר תאי ה-EVT האנושיים ותפקידיהם האימונולוגיים בממשק העוברי-אימהי.
- הוא מספק בסיס לבדיקת סיבוכים של ההיריון הקשורים לדלקת בשילייה.
- מאפשר תובנות חדשות לגבי מנגנונים של סבילות חיסונית ופתופיזיולוגיה בהיריון אנושי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד ישיר ופנוטיפיקה של טרופובלסטים חוץ-וילואריים (EVT) מסוג HLA-G+ מרקמת שליה אנושית נותנים מענה לפער קריטי באימונולוגיה של הרבייה, ומאפשרים הפחתת סיכונים מכניסטית במקרים שבהם מודלים של בעלי חיים אינם מספקים מידע רלוונטי. פלטפורמה זו תומכת בביטחון חזוי במחקרי סבילות עוברית-אימהית ומסייעת בקבלת החלטות מותאמות סיכון עבור תוכניות המכוונות לסיבוכי היריון. המתודולוגיה ממוקמת באופן אסטרטגי למחקר תרגומי על מודולציה חיסונית בממשק העוברי-אימהי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה של מנגנוני סבילות חיסונית הייחודיים להיריון אנושי.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות עבור מולקולות כגון HLA-G, PD-L1 ו-PD-L2 ב-EVT.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטית עבור מסלולים המעורבים בדלקת של השליה.
- מספק מערכת ספציפית לבני אדם לבדיקת היפותזות במקרים שבהם מודלים של בעלי חיים אינם רלוונטיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק אוכלוסיות EVT בדרגת טוהר גבוהה עבור בדיקות אימונולוגיות סטנדרטיות.
- מאפשר אפיון פנוטיפי ותפקודי הדיר בשימוש בציטומטריה זרימה.
- תומך בהערכה כמותית של אינטראקציות בין תאי טרופובלסט פולשניים (EVT) לתאי מערכת החיסון האימהית בתרבית משותפת (co-culture).
- מכין מערכות תאים עוברי-תיקוף לצורך סריקה המשכית של תרכובות מודולטוריות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתכתב עם מודלים רלוונטיים למחלות של רעלת הריון, לידה מוקדמת ודלקת של השילשייה.
- מאפשר רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני במערכות רקמות אנושיות.
- תומך בזיהוי של סמנים ביולוגיים (biomarkers) תרגומיים לסיבוכי הריון.
- מספק פלטפורמה לקידום מותאם-סיכון של טיפולים תרופויטיים המודולים את מערכת החיסון.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
פרוטוקול זה משתלב ברצף השלב שבין הגילוי לשלב הפרה-קלייני עבור אימונולוגיה של הרבייה, ובכך הוא מגשר בין מחקרים מכניסטיים מוקדמים למחקר תרגומי על הפרעות בהריון.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות על סבילות חיסונית ותפקוד EVT בממשק האימי-עוברי.
- סריקה: מספקת הדמיות EVT סטנדרטיות וניתנות לשחזור עבור בדיקות אימונולוגיות כמותיות.
- אנליטיקה: מאפשרת זרימה של ציטומטריה רב-ממדית ומדדים תפקודיים לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים in vitro לפנוטיפים קליניים בסיבוכי הריון.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר למגוון מחקרי אימונולוגיה אימיים-עובריים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי הריון באדם.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של בידוד ואפיון של EVT לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס לקבלת החלטות לגבי קידום או עצירה (go/no-go) של התערבויות למודולציה חיסונית בהריון.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של תוכניות המכוונות לדלקת של השילייה ולהפרעות קשורות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ברקמת שליה ובציטומטריה של זרימה.
- מחייב גישה למכשור FACS ולפלטפורמות אנליטיות רב-ממדיות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לצורך בידוד תאים ואפיון פנוטיפי הדירים.
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמה עבור מקורות רקמה פתולוגיים לעומת רקמה בריאה.
- מוגבל בשל היעדר אורתולוגים במודלים של בעלי חיים, מה שמדגיש את הצורך בגישה לרקמה אנושית.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:38
Isolation and Separation of Chorionic Membrane and Decidua Parietalis from Human Placenta
2:14
Dissection and Preparation of Decidua Basalis from Human Placenta
3:27
Enzymatic Digestion of the Chorionic Membrane and Decidua Basalis
5:22
Ficoll Separation
6:05
Sorting of Extravillous Trophoblast Cells
6:56
Results
8:06
Conclusion
