Name: הכנת דגימה אוטומטית לניתוח מולטי-פלקסי של שינויים פוסט-תרגומיים בהיסטונים חד-תאיים (sc-hPTM2) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-19T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: למדו פרוטוקול אוטומטי לניתוח מולטי-פלקסי של שינויים פוסט-תרגומיים בהיסטונים ברזולוציית תא בודד. השיטה משפרת רגישות ושחזוריות בחקר הטרוגניות כרומטין בתאי Hep G2/C3A.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Res. 21 (3), 381-395 (2011).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
<li>Sidoli, S., Bhanu, N. V., Karch, K. R., Wang, X., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+workflow+for+analysis+of+histone+post-translational+modifications+using+bottom-up+mass+spectrometry%3A+from+histone+extraction+to+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Complete workflow for analysis of histone post-translational modifications using bottom-up mass spectrometry: from histone extraction to data analysis.</a> J Vis Exp. (111), e54112(2016).</li>
<li>Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCoPE-MS%3A+mass+spectrometry+of+single+mammalian+cells+quantifies+proteome+heterogeneity+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation.</a> Genome Biol. 19 (1), 161(2018).</li>
<li>Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+protein+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell protein analysis by mass spectrometry.</a> Curr Opin Chem Biol. 60 (1), 1-9 (2021).</li>
<li>Leduc, A., Khoury, L., Cantlon, J., Khan, S., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+sample+preparation+for+multiplexed+single-cell+proteomics+using+nPOP%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Massively parallel sample preparation for multiplexed single-cell proteomics using nPOP.</a> Nat Protoc. 19 (12), 3750-3776 (2024).</li>
<li>Lund, P. J., Kori, Y., Zhao, X., Sidoli, S., Yuan, Z. F., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopic+labeling+and+quantitative+proteomics+of+acetylation+on+histones+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isotopic labeling and quantitative proteomics of acetylation on histones and beyond.</a> Methods Mol Biol. 1977 (1), 43-70 (2019).</li>
<li>Cutler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+profiling+of+single-cell+histone+post-translational+modifications+to+dissect+chromatin+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based profiling of single-cell histone post-translational modifications to dissect chromatin heterogeneity.</a> Nature Communications. , (2025).</li>
<li>Davie, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+histone+deacetylase+activity+by+butyrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Inhibition of histone deacetylase activity by butyrate.</a> J Nutr. 133 (7 Suppl), 2485S-2493S (2003).</li>
<li>Stransky, S., Cutler, R., Aguilan, J., Nieves, E., Sidoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+reversible+histone+acetylation+and+dynamics+in+gene+expression+regulation+using+3D+liver+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Investigation of reversible histone acetylation and dynamics in gene expression regulation using 3D liver spheroid model.</a> Epigenetics Chromatin. 15 (1), 35-35 (2022).</li>
<li>Stransky, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automated+phenotypic+analysis+of+functional+3D+spheroid+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Semi-automated phenotypic analysis of functional 3D spheroid cell cultures.</a> J Vis Exp. (1), e65086(2023).</li>
<li>Yuan, Z. F., Sidoli, S., Marchione, D. M., Simithy, J., Janssen, K. A., Szurgot, M. R., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiProfile+2.0%3A+a+computational+platform+for+processing+epi-proteomics+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">EpiProfile 2.0: a computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data.</a> J Proteome Res. 17 (7), 2533-2541 (2018).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל</td><td>ביו-ראד</td><td>2239480</td><td></td></tr><tr><td>1000 ומיקרו; קצות פיפט ברוחב L</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14222703</td><td></td></tr><tr><td>200 ומיקרו; קצות פיפט ברוחב L</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14222730</td><td></td></tr><tr><td>לוח PCR 384 באר Lo Bind&nbsp;</td><td>אפנדורף</td><td>30129547</td><td></td></tr><tr><td>מניפולד ואקום עם 96 בארות</td><td>מיליפור</td><td>MAVM0960R</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל, דרגת Optima LC-MS/MS</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>לוחות PCR דביקים</td><td>תרמו פישר</td><td>AB0626</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל חסר מים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>AA42311AK</td><td>תמיסת המלאי לתפזיר</td></tr><tr><td>Arg-C אולטרה, דרגת מסה</td><td>פרומגה</td><td>VA1831</td><td></td></tr><tr><td>מים ברמת תרבית תאים</td><td>קורנינג</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>CellenVIALs</td><td>סייניון</td><td>/</td><td>מספר הקטלוג מגיע עם הצעת מחיר</td></tr><tr><td>DMSO, אנהידרוס</td><td>תרמו פישר</td><td>D12345</td><td>תמיסת סטוק לתוויות</td></tr><tr><td>DTT</td><td>סיגמא</td><td>D0632-5G</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>MT17205CV</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פורמית</td><td>תרמו</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פורמית 98%&ndash; 100% ל-LC-MS LiChropur</td><td>סיגמא</td><td>5330020050</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>MT21022CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (אולטרה פיור)</td><td>תרמו פישר</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל בדרגת HPLC</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>מים בדרגת HPLC</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת הידרוקסיאמין 50&nbsp;wt. % ב-H2O</td><td>סיגמא</td><td>438227-50ML</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>MT25015CI</td><td></td></tr><tr><td>דטרגנט n-Dodecyl-beta-Maltoside (DDM)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BN2005</td><td></td></tr><tr><td>חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>MT25025CI</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרומטר המסה Orbitrap Exploris 480</td><td>תרמו פישר</td><td>BRE725539</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד 16% תמיסה מימית בדרגת EM</td><td>מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>PDC-CM (ציפוי סוג 2)</td><td>סייניון</td><td>/</td><td>מספר הקטלוג מגיע עם הצעת מחיר</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>MT3002CI</td><td></td></tr><tr><td>סליין מפוזר-פוספט (PBS), 10x, pH 7.4, ללא RNase</td><td>תרמו פישר</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>פירס דימתילסולפוקסיד (DMSO), דרגת LC-MS</td><td>תרמו פישר</td><td>85190</td><td></td></tr><tr><td>רובה פיפטה</td><td>אפנדורף</td><td>Z666467 (מיליפור סיגמא)</td><td></td></tr><tr><td>אנידריק פרופיוני &GE; 99%</td><td>סיגמא</td><td>240311-50G</td><td></td></tr><tr><td>אנידריד פרופיוני-d10 &ge; 98 אטום % D, &ge; 99% (CP)</td><td>סיגמא</td><td>615692-1G</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה מקוררת</td><td>תרמו</td><td>75-217-420</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות זכוכית מצופות SciCHIP H1</td><td>סייניון</td><td>/</td><td>מספר הקטלוג מגיע עם הצעת מחיר</td></tr><tr><td>מרוכז ואקום SpeedVac (לוחות 96 בארים)</td><td>תרמו</td><td>15308325</td><td>סוואנט SPD1010</td></tr><tr><td>מכסה מנוע סטרילי</td><td>תרמו</td><td>1375</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות סטריליות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>1367549</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green Dead Stain, לציטומטריית זרימה</td><td>תרמו פישר</td><td>S34860</td><td></td></tr><tr><td>אנזים TrypLE Express (1X), ללא פנול אדום</td><td>תרמו פישר</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>מערבולת</td><td>סיגמא</td><td>Z258415</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FSGPD10</td><td></td></tr></tbody></table>

הכנת דגימה אוטומטית לניתוח מולטי-פלקסי של שינויים פוסט-תרגומיים בהיסטונים חד-תאיים (sc-hptm2)

Automated Sample Preparation for the Multiplexed Analysis of Single-Cell Histone Post-Translational Modifications (sc-hPTM2)

כדי להדגים את יישום תהליך העבודה של פרוטאומיקת היסטונים חד-תאית באמצעות המערכת שלנו, ניתחנו ספרואידים של תאי HepG2/C3A שטופלו ב-5 mM נתרן בוטיראט במשך 24 שעות. לאחר רכישת LC-MS/MS, נתונים גולמיים עובדו באמצעות EpiProfile הן לתיוג קל (אנידיד פרופיוני) והן לתיוג כבד (אנהידריד פרופיוני-d10), וקיבלו נתונים מנורמלים המייצגים את שפע הפפטידים וסימני ההיסטונים. חבילת QuantQC R שימשה למיפוי מטא-דאטה של המטפל בנוזל לפלטי ה-EpiProfile במטרה לקבל מידע על תכולת הפפטידים והשפע הקשור לכל תא, ואז סיננה פפטידופורמים שלא זוהו באופן עקבי ל...

הכנת דגימה אוטומטית לניתוח מולטי-פלקסי של שינויים פוסט-תרגומיים בהיסטונים חד-תאיים (sc-hPTM2)

Histone post-translational modifications (hPTMs) are central regulators of chromatin organization and gene expression. Their dysregulation is implicated ...

automated-sample-preparation-for-multiplexed-analysis-single-cell

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פרוטוקול זה מתאר עבודה משולבת במלואם לאפיון היסטון שלאחר translational שינויים באמצעות ספקטרומטריית מסה (MS). זרימת העבודה כוללת טיהור היסטון מן בתרביות תאים או רקמות, היסטון derivatization ועיכול, ניתוח MS באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ננו זרימה והוראות לניתוח נתונים. הפרוטוקול מיועד להשלמה בתוך 2 - 3 ימים.

Workflow השלם עבור ניתוח שלאחר translational שינויים היסטון שימוש מלמטה למעלה ספקטרומטריית מסה: מתוך הפקת היסטון כדי ניתוח נתונים

כתב היד מתאר שיטות להחלת הטכנולוגיה microarray פפטיד פרופיל פרופיליות של נוגדנים כי לזהות היסטונים ושינויים שלאחר translational שלהם.

ניתוח של היסטון נוגדנים היסטון עם Microprays פפטיד

מטרת מאמר זה היא לספק מדריך מקיף, שיטתית של טיהור יעיל של שינויים היסטוניים H3 ו- H4, כימות של שאריות היסטון acetylated.

טיהור של H3, H4 חלבוני היסטון, כימות של סימני היסטון Acetylated תאים ורקמות המוח

זרימת עבודה זו מתארת את ביצועי הזמן והעשרת העלויות היעילות של שינויים מרובים בחלבון שלאחר ההעברה (לפטין) בו זמנית עבור ניתוח פרוטמית גלובלי כמותי. הפרוטוקול מנצל את העשרה ברמת הפפטיד PTM עם נוגדנים מרובה מצוחים, ואחריו נתונים עצמאיים רכישה המסה ניתוח ספקטרומטר מאסה כדי לקבל תובנות ביולוגיות לתוך הוצלב PTM.

העשרת אהדה בו של שני שינויים שלאחר ההעברה לקוונפיקציה ולוקליזציה לאתר

כאן, המחברים מציגים את התועלת של MULTI-seq עבור פנוטיפ והצמד הבא scRNA-seq ו- scATAC-seq באפיון פרופילי הנגישות של תעתיק וכרומטין ברשתית.

ניתוח מרובב של ביטוי גנים ברשתית ונגישות כרומטין באמצעות scRNA-Seq ו- scATAC-Seq

פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להשתמש במערכת תרביות תאים תלת-ממדית כדי למדל, לטפל ולנתח שינויי כרומטין במצב כמעט פיזיולוגי.

כימות ברמה הגלובלית של שינויים פוסט-תרגומיים של היסטון במודל תרבית תאים תלת-ממדית של רקמת כבד

עבודה זו מתארת פרוטוקול לכימות שינויים גלובליים בהיסטון באמצעות ציטומטריית זרימה תוך-גרעינית במיקרוגליה מבודדת במוח. העבודה מכילה גם את פרוטוקול בידוד תאי המיקרוגליה ששימש לאיסוף נתונים.

כימות שינויים גלובליים בהיסטון לאחר תרגום באמצעות ציטומטריית זרימה תוך-גרעינית במיקרוגליה מבודדת במוח עכבר

תהליך עבודה אנליטי המבוסס על כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים וספקטרומטריית מסה של זמן טיסה (LC-TIMS-ToF MS/MS) לביטחון גבוה וניתוח "מלמטה למעלה" בעל יכולת שחזור גבוהה של שינויים וזיהוי של היסטון בהתבסס על פרמטרים עיקריים (זמן שמירה [RT], חתך התנגשות [CCS] ויחס מסה למטען מדויק [m/z]).

בדיקת שינוי היסטון באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים וספקטרומטריית מסה בזמן טיסה

פרוטוקול זה מאפשר חילוץ היסטונים יעיל מדגימות קליניות שונות לניתוח לאחר שינוי תרגומי על ידי LC-MS/MS. על ידי הקלה על זיהוי חזק של שינויים מרכזיים בהיסטונים, היא משמשת ככלי חשוב לפרופילינג אפיגנטי מקיף בקבוצות קליניות גדולות.

חילוץ היסטונים מדגימות קליניות לפרופיל אפיגנטי באמצעות ספקטרומטריית מסה

וריאנטים גנטיים בבני אדם מסוג ספינדלין ממשפחת 4 (SPIN4) זוהו לאחרונה אצל חולים עם עודף התפתחות עצם, הפרעה התפתחותית חדשה. מוצגים פרוטוקול ותוצאות חדשות המתארות את הזיהוי הביוכימי של היסטונים מותאמים בהקשר של נוקלאוזומים כסובסטרטים של קישור SPIN4.

זיהוי היסטונים שעברו שינוי כסבסטרטים קשירים של בני משפחת הספינדלין האנושיים 4 (SPIN4) באמצעות מערכי פפטידים ומשיכת נוקלאוזום טבעית

מחקר זה מציג פרוטוקול מולטיאום מרחבי Trekker–CUT&amp;Tag, המשלב ברקידוד מרחבי ישיר של חתך רקמה עם ניתוח מולטיאום חד-תאים. גישה זו מאפשרת פרופילינג חד-תאי של ביטוי גנים ושינוי ההיסטון H3K27ac בו-זמנית, ומציעה תובנות מכניות על ויסות גנים בהקשר של מיקרואנטומיה של רקמות.

לאחר פתרון מרחבי, פרופיילינג מולטיאומי חד-תאי משולב של מטרות טרנסקריפטום ואפיגנומיה בחתכי רקמה קפואים.

למדו פרוטוקול אוטומטי לניתוח מולטי-פלקסי של שינויים פוסט-תרגומיים בהיסטונים ברזולוציית תא בודד. השיטה משפרת רגישות ושחזוריות בחקר הטרוגניות כרומטין בתאי Hep G2/C3A.

הכנת דגימה אוטומטית לניתוח מולטי-פלקסי של שינויים פוסט-תרגומיים בהיסטונים חד-תאיים (sc-hPTM2)

גלה סרטונים נוספים