הכנת דגימה אוטומטית לניתוח מולטי-פלקסי של שינויים פוסט-תרגומיים בהיסטונים חד-תאיים (sc-hPTM2)
December 19th, 2025
כאן אנו מציגים פרוטוקול לאוטומציה של ניתוח שינוי פוסט-תרגומי של היסטונים חד-תאיים באמצעות אסטרטגיית תיוג איזוטופי דו-פלקס ועיכול ArgC. תהליך עבודה זה מאפשר פרופילינג כמותי, שכפול ורגיש מאוד של הטרוגניות כרומטין ותגובות אפיגנטיות ברזולוציה של תא יחיד.
אנו מקדמים פרוטאומיקה חד-תאית באמצעות שיטת מולטיפלקס אוטומטית לחקר הטרוגניות כרומטין גלובלית לשינויים פוסט-תרגומיים. מה שמאתגר את הפרוטוקול הזה הוא הכנת הפרוטאומית בקנה מידה פיקוגרמה, תיוג מולטיפלקס, וכן פתרון פפטידי היסטונים מורכבים שעברו שינוי קומבינטורי. כדי להתחיל, לשחזר תאי קרצינומה כבדית של Hep G2/C3A בריכוז סופי של 200 עד 500 תאים למיקרוליטר ב-PBS קר מאוד.
הגדר את רוחב הפולס ומתח ההנעה של כל פיה לערכים שמספק היצרן. ליעילות איסוף מקסימלית, ודא שהסטייה של ה-Z בין שתי הפיות שונה בפחות מ-50 מיקרומטר. זהה את מיקום המגע האופטימלי לכל פיה והשווה את קריאות גובה ה-Z בלשונית הגדרת הפיה.
בתכנית מולטי-פלקס של טופלקס, טעין סלייד יחיד על מחזיק הסלייד שבמכסה המנוע ואז מעביר אותו למכשיר. באמצעות פיפטה, מחברים 150 מיקרוליטר DMSO בדרגת LCMS לצינור PCR חדש. הניחו אותו במיקום השני של תחנת הכביסה עם פקק הצינור מול דלת המכשירים.
תתחיל את הריצה ל-DMSO. קבל דרופ יציב לאחר ש-DMSO עבר שאיפה. שימו לב לשינוי בשקיפות ה-PDC.
ייתכן שיהיה צורך להעלות את המתח. בדוק יציבות על ידי בדיקת נפילה בעוצמת הקול. בצע את הגדרת אשף מצלמת הראש כדי ליישר את המצלמה.
יש לחלק DMSO ולאפשר למכשיר לשטוף אוטומטית את הפיות ולצלם תמונות בכל השקופיות לבקרת איכות. בדוק את התמונות הללו כדי לוודא טיפה אחידה של DMSO בכל שקופית ולבדוק אם טיפות חסרות או לא במטרה. לאחר שאיפת תליית התא, פתח את התא במודול אחד, בצע לכידת רקע ואז הרץ את שגרת המיפוי כדי להגדיר את אזור הפליטה.
הרץ את הניתוח ואז פתח את החלקיקים כדי לבחור תאים לפי גודל והארכה. כעת, הכינו תערובת עיכול טרייה במים בדרגת LCMS. נקה גזים מהתמיסה עם משאבת ואקום למשך 10 דקות על הקרח.
לאחר שפיזור תערובת העיכול על השקופיות, תן לכלי לשטוף אוטומטית את הפיות ולצלם כל שקופית. בדוק את התמונות כדי לוודא שכל טיפה מקבלת את תערובת העיכול באופן אחיד. דגרו את המגלשות בטמפרטורת החדר למשך הלילה לביצוע עיכול.
לאחר תחילת ריצת האידוי והעיכול הלילי, בדוק את התמונות. אם הטיפות יבשות מספיק, עצור את הריצה. אם לא, לחץ המשך וייבש עוד חמש דקות.
לצורך תיוג, תחילה הכן פתרונות מלאי לגזירת היסטונים מרוב-פלקס. לאחר הפינוי, אפשר למכשיר לשטוף אוטומטית את הפיות ולצלם כל שקופה. בדוק את התמונות כדי לוודא התפלגות אחידה ומיקום נכון של הטיפות בכל השקופיות.
לאחר סיום הדגירה, מחלקים את תמיסת הידרוקסילאמין להקרבה. כדי לאסוף את הדגימה, בחר את הריצה בלשונית הראשית, ואז התחל את הריצה בלשונית הריצה. לאחר סיום האיסוף, בדוק את התמונות כדי לבדוק שגיאות.
לאחר סיום הפיקאפ, הסר את המכסה מפלטת האיסוף. לאחר מכן ייבשו את הדגימות בחום נמוך במרכז ואקום. לצורך רכישת נתונים, תכנתו את שיטת הכרומטוגרפיה הנוזלית בעלת ביצועים גבוהים.
הגדר את ניסוי MS 2 כך שיכלול חלונות בידוד עם עומס יתר של 50, התנגשות אנרגטית גבוהה של 27% ויעד שליטה אוטומטית ברווח של 1000%. כסה את הלוח במזרן אטם גומי והנח אותו בתוך הסמפלר האוטומטי. לאחר קבלת קבצים גולמיים, בדוק בקצרה את הכרומטוגרמה ואז הרץ את הנתונים הגולמיים בגרסה 2.1 של EpiProfile. בדוק את טבלת הפלט של שפע PTM היסטוני מנורמל והשתמש בה לניתוחים במורד הזרם.
20 הפפטידופורמים הראשונים של היסטון H3 נמדדו, והראו את השפע היחסי שלהם בתנאים שטופלו בבקרה ובנתרן בוטיראט. גם אצטילציה של H3 K9 וגם אצטילציה של H3 K 14 הציגו שפע יחסי גבוה יותר בטיפול בנתרן בוטיראט. בעוד אצטילציית K9 של H3, אצטילציה K14 נראתה מועשרת אף יותר בתאים מטופלים.
רמות האצטילציה הכוללות עלו לאחר טיפול בנתרן בוטיראט עם תאים מטופלים עם התפלגות שגיאה רחבה יותר בהשוואה לביקורת, מה שמשקף את ההטרוגניות הגבוהה יותר שנאספה ברמת התא היחיד. הכימות של שינויים היסטונים בודדים ומקבילים הראתה כי מצבי אצטילציה קומבינטוריים מושפעים בעיקר מבוטיראט נתרן. הפיזור הרחב יותר של תאי נתרן בוטיראט הצביע על הטרוגניות ביולוגית מוגברת בין תאים בודדים בתוך הספרואידים.
פרוטוקול זה סוגר את הפער במחקר אפיגנטי בכך שהוא מאפשר למדענים לחקור מצבי כרומטין בתמיסה חד-תאית. תהליך עבודה זה מאפשר הכנת דגימות בתפוקה גבוהה, ריבוב דגימות וספקטרומטריית מסה בלתי מוטה, כדי לייצר נתונים אפיגנטיים חד-תאיים רגישים וכמותיים. מחקר עתידי יחקור כיצד ויסות הכרומטין משנה מצבי מחלה כמו סרטן, מחלות מטבוליות והזדקנות.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לאוטומציה של ניתוח שינוי היסטון פוסט-תרגום בודד-תא באמצעות אסטרטגיה של תיוג דו-פלקסי איזוטופי. זרימת העבודה מאפשרת פרופילים כמותיים ורגישים גבוהים של הטרוגניות כרומטין ברזולוציית תא בודד.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- פרוטאומיקה של תא בודד
- שינויים פוסט-תרגומיים של היסטון
- ניתוח כרומטין
רקע
- ניתוח תא בודד הוא קריטי להבנת ההטרוגניות התאית.
- שינויים פוסט-תרגומיים משחקים תפקיד מרכזי בוויסות מבנה ותפקוד הכרומטין.
- שיטות אוטומטיות יכולות לשפר את הנשנות והרגישות במחקרים פרוטאומיים.
- האתגרים כוללים טיפול בגדלי דגימה קטנים ותערובות פפטידים מורכבות.
מטרת המחקר
- לפתח פרוטוקול חזק לניתוח שינויי היסטון ברזולוציית תא בודד.
- לשפר את היעילות של תיוג מרובע ברזולוציות פרוטאומיות.
- להתמודד עם האתגרים של פפטידים היסטון בעלי שפע נמוך.
שיטות ששימשו
- שחזור של תאי Hep G2/C3A ב-PBS בריכוז מוגדר.
- כוונון פרמטרים של זרבובית לאיסוף דגימה מיטבי.
- יישום של תיוג דו-פלקסי איזוטופי לכימות.
- שימוש בפירוק ArgC להכנת פפטידים.
תוצאות עיקריות
- אוטומציה מוצלחת של ניתוח שינוי היסטון בודד-תא.
- רגישות גבוהה ונשנות מוכחות בפרופילים.
- רזולוציה אפקטיבית של פפטידים היסטון משובחים קומבינטוריים מורכבים.
- תובנות על הטרוגניות כרומטין ותגובות אפיגנטיות.
מסקנות
- הפרוטוקול שפותח משפר את המחקר על הדינמיקה של הכרומטין ברזולוציית תא בודד.
- אוטומציה משפרת באופן משמעותי את היעילות של ניתוח שינויי היסטון.
- שיטה זו יכולה להיות מיושמת על שאלות ביולוגיות שונות בנוגע לאפיגנטיקה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Automated single-cell histone PTM analysis addresses the critical challenge of resolving chromatin heterogeneity and epigenetic regulation at cellular resolution. This workflow enhances predictive confidence in early discovery by enabling quantitative, multiplexed profiling of histone modifications across individual cells. The approach supports risk-adjusted portfolio decisions by providing high-content, reproducible data on epigenetic states relevant to disease and therapeutic modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of chromatin regulatory mechanisms at the single-cell level.
- Supports functional target validation by quantifying histone PTM changes in response to perturbations.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct measurement of epigenetic heterogeneity.
- Improves predictive confidence for target selection and triage in epigenetic drug discovery.
Screening & Assay Development
- Prepares validated single-cell systems for downstream screening of epigenetic modulators.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative histone PTM readouts for assay development.
- Enables multiplexed comparison of treatment conditions using isotopic labeling strategies.
- Supports scalable, high-throughput workflows for compound evaluation in chromatin biology.
Translational & Preclinical Research
- Aligns single-cell epigenetic profiling with disease-relevant models such as tumor spheroids.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by capturing cellular heterogeneity in response to therapeutic agents.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative chromatin state data.
- Supports translational biomarker identification for epigenetic drug development.
Pipeline & Workflow Integration
This automated protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling high-content, quantitative analysis of histone PTMs at single-cell resolution.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving cell-to-cell chromatin variability.
- Screening: Provides assay-ready, multiplexed outputs for robust compound screening and comparison.
- Analytics: Delivers quantitative, normalized histone PTM abundance tables for statistical analysis and condition comparison.
- Translational Research: Connects single-cell epigenetic data to disease models and therapeutic response evaluation.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, automated capability for ongoing epigenetic profiling across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in chromatin-targeted discovery.
- Operational Value: Standardizes and automates sample preparation for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by providing high-content, quantitative data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of epigenetic targets and compounds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell proteomics and mass spectrometry data analysis.
- Needs access to automated nano liquid handling and high-resolution LC-MS instrumentation.
- Demands cross-team standardization for sample preparation and data processing workflows.
- Adaptation may be needed for different cell types or disease models.
- Throughput and sensitivity are limited by instrument capacity and sample handling precision.
