הכנת דגימה אוטומטית לניתוח מולטי-פלקסי של שינויים פוסט-תרגומיים בהיסטונים חד-תאיים (sc-hPTM2)
19 בדצמבר 2025
כאן אנו מציגים פרוטוקול לאוטומציה של ניתוח שינוי פוסט-תרגומי של היסטונים חד-תאיים באמצעות אסטרטגיית תיוג איזוטופי דו-פלקס ועיכול ArgC. תהליך עבודה זה מאפשר פרופילינג כמותי, שכפול ורגיש מאוד של הטרוגניות כרומטין ותגובות אפיגנטיות ברזולוציה של תא יחיד.
אנו מקדמים פרוטאומיקה חד-תאית באמצעות שיטת מולטיפלקס אוטומטית לחקר הטרוגניות כרומטין גלובלית לשינויים פוסט-תרגומיים. מה שמאתגר את הפרוטוקול הזה הוא הכנת הפרוטאומית בקנה מידה פיקוגרמה, תיוג מולטיפלקס, וכן פתרון פפטידי היסטונים מורכבים שעברו שינוי קומבינטורי. כדי להתחיל, לשחזר תאי קרצינומה כבדית של Hep G2/C3A בריכוז סופי של 200 עד 500 תאים למיקרוליטר ב-PBS קר מאוד.
הגדר את רוחב הפולס ומתח ההנעה של כל פיה לערכים שמספק היצרן. ליעילות איסוף מקסימלית, ודא שהסטייה של ה-Z בין שתי הפיות שונה בפחות מ-50 מיקרומטר. זהה את מיקום המגע האופטימלי לכל פיה והשווה את קריאות גובה ה-Z בלשונית הגדרת הפיה.
בתכנית מולטי-פלקס של טופלקס, טעין סלייד יחיד על מחזיק הסלייד שבמכסה המנוע ואז מעביר אותו למכשיר. באמצעות פיפטה, מחברים 150 מיקרוליטר DMSO בדרגת LCMS לצינור PCR חדש. הניחו אותו במיקום השני של תחנת הכביסה עם פקק הצינור מול דלת המכשירים.
תתחיל את הריצה ל-DMSO. קבל דרופ יציב לאחר ש-DMSO עבר שאיפה. שימו לב לשינוי בשקיפות ה-PDC.
ייתכן שיהיה צורך להעלות את המתח. בדוק יציבות על ידי בדיקת נפילה בעוצמת הקול. בצע את הגדרת אשף מצלמת הראש כדי ליישר את המצלמה.
יש לחלק DMSO ולאפשר למכשיר לשטוף אוטומטית את הפיות ולצלם תמונות בכל השקופיות לבקרת איכות. בדוק את התמונות הללו כדי לוודא טיפה אחידה של DMSO בכל שקופית ולבדוק אם טיפות חסרות או לא במטרה. לאחר שאיפת תליית התא, פתח את התא במודול אחד, בצע לכידת רקע ואז הרץ את שגרת המיפוי כדי להגדיר את אזור הפליטה.
הרץ את הניתוח ואז פתח את החלקיקים כדי לבחור תאים לפי גודל והארכה. כעת, הכינו תערובת עיכול טרייה במים בדרגת LCMS. נקה גזים מהתמיסה עם משאבת ואקום למשך 10 דקות על הקרח.
לאחר שפיזור תערובת העיכול על השקופיות, תן לכלי לשטוף אוטומטית את הפיות ולצלם כל שקופית. בדוק את התמונות כדי לוודא שכל טיפה מקבלת את תערובת העיכול באופן אחיד. דגרו את המגלשות בטמפרטורת החדר למשך הלילה לביצוע עיכול.
לאחר תחילת ריצת האידוי והעיכול הלילי, בדוק את התמונות. אם הטיפות יבשות מספיק, עצור את הריצה. אם לא, לחץ המשך וייבש עוד חמש דקות.
לצורך תיוג, תחילה הכן פתרונות מלאי לגזירת היסטונים מרוב-פלקס. לאחר הפינוי, אפשר למכשיר לשטוף אוטומטית את הפיות ולצלם כל שקופה. בדוק את התמונות כדי לוודא התפלגות אחידה ומיקום נכון של הטיפות בכל השקופיות.
לאחר סיום הדגירה, מחלקים את תמיסת הידרוקסילאמין להקרבה. כדי לאסוף את הדגימה, בחר את הריצה בלשונית הראשית, ואז התחל את הריצה בלשונית הריצה. לאחר סיום האיסוף, בדוק את התמונות כדי לבדוק שגיאות.
לאחר סיום הפיקאפ, הסר את המכסה מפלטת האיסוף. לאחר מכן ייבשו את הדגימות בחום נמוך במרכז ואקום. לצורך רכישת נתונים, תכנתו את שיטת הכרומטוגרפיה הנוזלית בעלת ביצועים גבוהים.
הגדר את ניסוי MS 2 כך שיכלול חלונות בידוד עם עומס יתר של 50, התנגשות אנרגטית גבוהה של 27% ויעד שליטה אוטומטית ברווח של 1000%. כסה את הלוח במזרן אטם גומי והנח אותו בתוך הסמפלר האוטומטי. לאחר קבלת קבצים גולמיים, בדוק בקצרה את הכרומטוגרמה ואז הרץ את הנתונים הגולמיים בגרסה 2.1 של EpiProfile. בדוק את טבלת הפלט של שפע PTM היסטוני מנורמל והשתמש בה לניתוחים במורד הזרם.
20 הפפטידופורמים הראשונים של היסטון H3 נמדדו, והראו את השפע היחסי שלהם בתנאים שטופלו בבקרה ובנתרן בוטיראט. גם אצטילציה של H3 K9 וגם אצטילציה של H3 K 14 הציגו שפע יחסי גבוה יותר בטיפול בנתרן בוטיראט. בעוד אצטילציית K9 של H3, אצטילציה K14 נראתה מועשרת אף יותר בתאים מטופלים.
רמות האצטילציה הכוללות עלו לאחר טיפול בנתרן בוטיראט עם תאים מטופלים עם התפלגות שגיאה רחבה יותר בהשוואה לביקורת, מה שמשקף את ההטרוגניות הגבוהה יותר שנאספה ברמת התא היחיד. הכימות של שינויים היסטונים בודדים ומקבילים הראתה כי מצבי אצטילציה קומבינטוריים מושפעים בעיקר מבוטיראט נתרן. הפיזור הרחב יותר של תאי נתרן בוטיראט הצביע על הטרוגניות ביולוגית מוגברת בין תאים בודדים בתוך הספרואידים.
פרוטוקול זה סוגר את הפער במחקר אפיגנטי בכך שהוא מאפשר למדענים לחקור מצבי כרומטין בתמיסה חד-תאית. תהליך עבודה זה מאפשר הכנת דגימות בתפוקה גבוהה, ריבוב דגימות וספקטרומטריית מסה בלתי מוטה, כדי לייצר נתונים אפיגנטיים חד-תאיים רגישים וכמותיים. מחקר עתידי יחקור כיצד ויסות הכרומטין משנה מצבי מחלה כמו סרטן, מחלות מטבוליות והזדקנות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לאוטומציה של ניתוח מודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות של היסטונים בתא בודד, תוך שימוש באסטרטגיית תיוג איזוטופית דו-רכיבית (two-plex). תהליך העבודה מאפשר פרופיילינג כמותי ובעל רגישות גבוהה של הטרוגניות הכרומטין ברזולוציה של תא בודד.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- פרוטאומיקה של תא בודד
- מודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות של היסטונים
- ניתוח כרומטין
רקע
- ניתוח של תאים בודדים הוא חיוני להבנת ההטרוגניות התאית.
- מודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות ממלאות תפקיד מרכזי בבקרת מבנה הכרומטין ותפקודו.
- שיטות אוטומטיות יכולות לשפר את השחזוריות והרגישות במחקרים פרוטאומיים.
- האתגרים כוללים טיפול בגדלי דגימות קטנים ובתערובות פפטידים מורכבות.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול חסון לניתוח מודיפיקציות של היסטונים ברזולוציה של תא בודד.
- שיפור היעילות של סימון רב-ערוצי (multiplex labeling) בתהליכי עבודה פרוטאומיים.
- מענה לאתגרים הכרוכים בפפטידים של היסטונים בריכוזים נמוכים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שחזור של תאי Hep G2/C3A ב-PBS בריכוז מוגדר.
- כיוון פרמטרי הדיזה (nozzle) לשאיבה אופטימלית של הדגימה.
- יישום סימון איזוטופי דו-פלקס (two-plex) לצורך כימות.
- שימוש בעיכול באמצעות ArgC להכנת הפפטידים.
תוצאות עיקריות
- אוטומציה מוצלחת של ניתוח מודיפיקציות היסטונים בתא בודד.
- הוכחת רגישות גבוהה והדירות (reproducibility) בפרופיילינג.
- רזולוציה יעילה של פפטידים של היסטונים עם מודיפיקציות קומבינטוריות מורכבות.
- תובנות לגבי הטרוגניות של כרומטין ותגובות אפיגנטיות.
מסקנות
- הפרוטוקול שפותח משפר את חקר הדינמיקה של הכרומטין ברזולוציה של תא בודד.
- אוטומציה משפרת משמעותית את היעילות של ניתוח מודיפיקציות להיסטונים.
- ניתן ליישם שיטה זו לשאלות ביולוגיות שונות הנוגעות לאפיגנטיקה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח אוטומטי של מודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות (PTM) של היסטונים ברמה של תא בודד נותן מענה לאתגר הקריטי של פענוח ההטרוגניות של הכרומטין והבקרה האפיגנטית ברזולוציה תאית. תהליך עבודה זה מגביר את הביטחון החיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי מתן אפשרות לאפיון כמותי ומרובה (multiplexed) של מודיפיקציות היסטונים בתאים בודדים. הגישה תומכת בקבלת החלטות מבוססות ניהול סיכונים עבור פורטפוליו של פיתוחים, באמצעות אספקת נתונים בעלי תוכן גבוה וניתנים לשחזור על מצבים אפיגנטיים הרלוונטיים למחלה ולמודולציה טיפולית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה של מנגנוני בקרה של כרומטין ברמת התא הבודד.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי כימות שינויים ב-PTM של היסטונים בתגובה להפרעות.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים באמצעות מדידה ישירה של הטרוגניות אפיגנטית.
- משפר את הביטחון החזוי לבחירה וסיווג של מטרות בתהליכי גילוי תרופות אפיגנטיות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מכין מערכות תאים בודדים שעברו תיקוף לצורך סריקה של מודולטורים אפיגנטיים בשלבים הבאים.
- מספק תוצאי PTM של היסטונים סטנדרטיים, הדירים וכמותיים לצורך פיתוח בדיקות (assays).
- מאפשר השוואה מרובת-דגימות (multiplexed) של תנאי טיפול באמצעות אסטרטגיות של סימון איזוטופי.
- תומך בתהליכי עבודה בעלי תפוקה גבוהה (high-throughput) וניתנים להרחבה להערכת תרכובות בביולוגיה של כרומטין.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה בין פרופיל אפיגנטי של תא בודד לבין מודלים רלוונטיים למחלה, כגון ספרואידים של גידולים.
- מספק רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף הפרה-קליני על ידי לכידה של ההטרוגניות התאית בתגובה לסוכנים טיפוליים.
- מאפשר קבלת החלטות על קידום מבוססות התאמה לסיכון, בהסתמך על נתונים כמותיים של מצב הכרומטין.
- תומך בזיהוי סמנים ביולוגיים (biomarkers) טרנסלציונליים לצורך פיתוח תרופות אפיגנטיות.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד (Pipeline)
פרוטוקול אוטומטי זה משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לניתוח כמותי ועשיר בתוכן של PTMs של היסטונים ברזולוציה של תא בודד.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים ביולוגיים על ידי פתרון השונות של הכרומטין בין תאים.
- סריקה: מספק פלטים מרובי-ערוצים (multiplexed) המוכנים לבדיקה, לצורך סריקה והשוואה חסונה של תרכובות.
- אנליטיקה: מספק טבלאות כמותיות ומנורמליות של שכיחות PTM של היסטונים לצורך ניתוח סטטיסטי והשוואת תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר נתונים אפיגנטיים של תא בודד למודלים של מחלות ולהערכת תגובה טיפולית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס יכולת אוטומטית וניתנת להרחבה (scalable) לפרופילינג אפיגנטי שוטף לאורך תוכניות מחקר.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בגילוי המכוון לכרומטין.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה ואוטומציה של הכנת הדגימות לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות טובה יותר לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ויעילות הונית באמצעות אספקת נתונים כמותיים בעלי תוכן גבוה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של מטרות תרופתיות ותרכובות אפיגנטיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בפרוטאומיקה של תא בודד ובניתוח נתוני ספקטרומטריית מסות.
- נדרשת גישה למערכות אוטומטיות לטיפול בנוזלים בננו-קנה מידה ולמכשור LC-MS ברזולוציה גבוהה.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית לתהליכי הכנת דגימות ועיבוד נתונים.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור סוגי תאים שונים או מודלים של מחלות.
- התפוקה והרגישות מוגבלות על ידי קיבולת המכשיר ודיוק הטיפול בדגימות.
