לוקליזציה RNAi ו ביטוי גנים מחוץ לרחם של עלוקה מרפא

העליקה הרפואית היא מערכת מודל שימושית למחקרים נוירוביולוגיים בשל פשטותה, נגישותה והאפשרות לזיהוי נוירונים סטטיים באמצעות מגוון כלים ניסויים, מהשלבים המוקדמים של העובר ועד לגיל זקנה. שימוש מרגש במיוחד בעובר העליקה הוא עבור מחקרי דימוי בשיטת time-lapse של צמיחת נוירונים בבעל חיים חי ושלם, בעקבות שינויים מדויקים מאוד בביטוי גנים בנוירון הנחקר או במטרה שלו. בסרטון זה, אנו מדגימים טכנולוגיה חדשנית להחדרה מהירה, מדויקת וממוקמת מאוד של ריאגנטים לשכבות פנימיות של עוברי עליקה חיים, באמצעות אקדח קפילרי פנאומטי שפותח בשיתוף פעולה בין המעבדה של אלכס גרוסמן למעבדה שלנו.

למרות שניתן ליישם טכניקה זו להעברה של DNA, RNA דו-גדילי או כל מולקולה אחרת שניתן להטעין על חלקיקי זהב מיקרוסקופיים, נשתמש בה הן עבור knockdown והן עבור knockin של מולקולת הניווט האקסונית Rin. שלום, אני מהמעבדה של אדוארדו אנו בחטיבה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת קליפורניה סן דייגו. היום נדגים לכם פרוצדורה לביצוע knockdown או knockin של הביטוי של מולקולת הניווט האקסונית networking, המבטאת באופן טבעי בדופן הגוף הוונטרלית, אך לא בדומיין הדורסלי של כל מקטעי הגוף של ה-lech.

אנו נחדיר מולקולות של RNA דו-גדילי או DNA פלסמי לדופן הגוף ולגנגליונים של סגמנטים נבחרים בשלבים מוקדמים של ההתפתחות. החדרה הוליסטית באמצעות אקדח קפילרי פנאומטי היא חשובה במיוחד מכיוון שהיא מאפשרת להפר את דפוסי הביטוי הגנים באזורים נבחרים של תת-סגמנט, תוך השארת הסגמנטים הבלתי מטופלים כביקורת פנימית. יתרה מכך, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להגיע לשכבות תאים פנימיות בשלבים מוקדמים של ההתפתחות ללא פגיעה ברקמה וללא פתיחת הדגימה.

לבסוף, להעברה הוליסטית יש את היתרון של יכולת מיקוד במספר מוגבל של תאים במיקום נבחר, מה שמהווה ביניים בין השתקה של תא בודד באמצעות מיקרו-הזרקה לבין השתקה סיסטמית באמצעות גישות גנטיות. אז בואו נתחיל. ה-LE הרפואי משמש מזה זמן רב לחקר תכונותיהם של תאי עצב ומעגלים עצביים הקשורים להתנהגות, וזאת בשל פשטותו של מערכת העצבים המרכזית, המורכבת מכ-200 זוגות בילטרליים של נוירונים וממערכת קטנה של גליות ענקיות.

בכל גנגליון סגמנטלי מתוך 21 סגמנטים של הגוף, וכל נוירון של העלוקה, ניתן לזיהוי ולמחקר חוזר מדגימה לדגימה, מהשלב העוברי המוקדם ועד לבגרות. מאז ימי הפרעונים, העלוקה שימשה למטרות עלוקה (bloodletting), והשימוש המתמשך בה ברפואה הופך אותה לזמינה בקלות מספקי בעלי חיים מסחריים. עם זאת, מכיוון שאנו חוקרים את התפתחות מערכת העצבים, אנו מחזיקים במעבדתנו מושבה חיה של מספר מאות עלוקות, המספקת לנו אספקה קבועה של עוברי עלוקה עבור ניסויינו.

עליקים הם הרמפרודיטים. יש להם מבנים נקביים וזכריים כאחד והם מבצעים הפרייה הדדית. לפיכך, כל הפרטים מסוגלים להטיל ביצים.

הם עושים זאת בתוך מבנה הנקרא קוקון (cocoon), אותו הם מייצרים בעצמם באמצעות מערכת של בלוטות מיוחדות המפרישות פולימרים מעניינים מאוד באזור בגוף הידוע כ-clitellum. עלוקה המוכנה להטיל ביצים חופרת את עצמה לתוך טחב, שאנו מספקים במיכלים, ומתחילה ליצור את הקוקון בצורת הביצה סביב גופה. כאשר חומר מספיק הופרש והמולקולות החלו להתפולימר, העלוקה מטילה ביצים, כמו גם חלמון תזונתי, לתוך הקוקון ומתפתלת החוצה. באמצעות להב תער, ניתן להוציא את העוברים על ידי חיתוך של פתח בקצה הקוקון.

בדרך כלל, כל גולם מכיל 10 עד 20 עוברים החל מהיום השישי בערך לאחר שהם מתחילים להבדיל. ניתן להוציא את העוברים מהגולם ולגדלם במי בריכה. בשלבים אלה אנו מתחילים בדרך כלל את המחקרים הניסיוניים שלנו על התפתחות נוירונלית.

השלב המרכזי הראשון בהליך זה הוא הכנת חלקיקים מצופים. בהדגמה זו, נראה כיצד להחדיר חלקיקי זהב מצופים במולקולות RNA דו-גדיליות של ה-lech homolog של מולקולת הכוונת האקסונים rin אל תוך עוברי lech. תאי המטרה הם תאי שריר אורכיים ונטרליים בדופן הגוף, הידועים ככאלה המבטאים ומשחררים Rin החל משלבים מוקדמים ב-Agenesis.

מטרתנו היא להפחית (knock down) את הביטוי הטבעי במקטע גוף בודד בשלב מוקדם ככל האפשר במהלך ההתפתחות, ולבחון כיצד הדבר משפיע על סיווגם של נוירונים הרגישים לגורם התפתחותי חשוב זה. לצורך שלב זה, נדרשים אמבט אולטרסוני (sonication bath), וורטקס, צנטריפוגת שולחנית ודלי קרח. כמו כן, נדרש isopropanol 100%, אותו יש להניח על קרח לפני השימוש.

התחל עם 100 µL של תמיסת קישור (binding buffer) המכילה 50 mg של חלקיקי vault ל-mL. חלקיקים אלו מיועדים ל-RNAi ומיוצרים על ידי חברת chell. לאחר מכן, דלל את תמיסת החלקיקים על ידי הוספת 100 µL של תמיסת קישור, ערבב במערבל Vortex לזמן קצר ובצע סוניקציה למשך דקה עד שתיים כדי להפריד חלקיקים שייתכן והצטברו לגושים.

לאחר שתי דקות של אינקובציה, הוסף 5 עד 10 µg של RNA דו-גדילי לחלקיקים, ערבב במכשיר vortex והשאר בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות. כעת, בתום שתי הדקות, סבב במערך צנטריפוגה את קומפלקסי ה-RNA הדו-גדילי והחלקיקים במהירות מינימלית של 2,500 RPM במיקרו-צנטריפוגה למשך כ-15 שניות.

כדי לקבל את המשקע, הסר את הנוזל העליון והוסף 750 µL של איזופרופנול תוך הפרעה מינימלית למשקע. סבב לזמן קצר במיקרו-צנטריפוגה והסר את הנוזל העליון לאחר הסבב, או השהה את חלקיקי הזהב ב-100% איזופרופנול קר באמצעות סוניקציה. בצע שני עד שלושה פולסים קצרים במקלט סוניקציה כדי להפריד את החלקיקים.

שפכו על סלייד זכוכית והמתינו עד שהממס יתאדה לחלוטין. התוצאות הטובות ביותר מתקבלות כאשר החלקיקים מצופים ממש לפני הזרקתם לרקמה, וזה מה שנראה לכם כיצד לבצע בשלב הבא. לפני ביצוע הטרנספקציה, בואו נעיף מבט במערך הניסוי ובאופן הכנתו.

אקדח קפילרי פנאומטי מותקן על מיקרו-מניפולטור להחדרה מדויקת של חלקיקים אל תוך העוברים. פני השטח של העובר מדויקים באמצעות מיקרוסקופ וידאו. לייזר מוליך למחצה מייצר קרן אור המופנית דרך הקפילרה הפנימית של האקדח ומשמשת לכיוון אל הרקמה המטרה.

קווי צינורות Titan נפרדים המחוברים לשלוש כניסות בראש האקדח מספקים גז הליום בלחץ ממקור יחיד. קו אחד פתוח תמיד, ובכך יוצר זרימה רציפה של גז הליום דרך האקדח. שני קווים נוספים סגורים בדרך כלל באמצעות שסתום סולנואיד ומכילים חלקיקי זהב עם שני ציפויים שונים שהוטענו לתוך הצינור.

כאבקה יבשה. הקפילריה החיצונית של האקדח מחוברת למערכת ואקום עם לחץ מד של 12.5- PSI. לחץ הראש של hi משתנה בין 10 ל-15 PSI כדי להתאים לעומק חדירת החלקיקים הרצוי.

לחץ הראש של ההליום יכול להשפיע באופן משמעותי על עומק חדירת החלקיקים, וכך גם המרחק מהעובר אל הרובה. קוטר הפיה, המשתנה בין רובי גנים שונים, הוא גורם שחשוב לבחור בהתאם לשטח המטרה. כעת, לאחר שהצגנו את מערך הניסוי שלנו, נטען את רובה ה-Jing שלנו ונירה לעבר עוברים של דגי lech.

לפני טעינת צינורית ה-Titan, קריטי שחלקיקי הזהב המצופים יהיו יבשים לחלוטין. ראשית, יש לגרד את חלקיקי הזהב המצופים מהלמיות הזכוכית באמצעות זכוכית כיסוי או להב תער, ואז הם מוכנים לטעינה לתוך פיסת נייר חלב (whey paper) מקופלת. יש לכופף את הצינורית לצורת U סמוך למחבר, כדי שחלקיקים לא יתפזרו לאורך כל הצינורית בעת טעינתם, אלא יתרכזו סמוך למחבר.

אספו את החלקיקים באמצעות שפכטל קטן או פיסת נייר שקילה בצורת V ומלאו את הצינורית. במהלך שלב המילוי, הקישו על הצינורית עם האצבע כדי לפזר את החלקיקים באופן אחיד. לאחר מילוי הצינורית, נוכל לעבור להחדרת ה-double stranded RNA באמצעות ה-Jing gun, אך לא לפני שנכין את העלוקים.

כאן ניתן לראות את עוברי העלוקה שלנו, שהם בני כ-10 ימים. הם נמצאים כעת במצע סטרילי שבו יישמרו הן לפני והן אחרי החדרת RNA דו-גדילי. השלב הראשון בהכנת העוברים הניסיוניים להחדרת RNA דו-גדילי הוא הוספת תמיסה של 8% ethanol במצע סטרילי לחתיכה שטוחה של סיליקון גמיש בעלת חריץ בצורת V.

מוסיפים עובר אחד ומניחים אותו כאשר הצד הגחוני פונה כלפי מעלה רגע לפני הפגזת החלקיקים. מנמיכים את המצע בתא כך שיהיה ממש מתחת למשטח העליון של העובר, ומניחים מעליו פיסת נייר סופג עם חור קטן שנגזר במרכזה כדי לייצב אותו ולמנוע מהמשטח שלו להתייבש, ובו בזמן לחשוף רק את האזור שיהיה היעד בשלב העוברי שבו אנו משתמשים היום. בשלב E 10, ניתן לאתר את תאי השריר האורכיים במרחק של כ-10 עד 20 micrometers מהמשטח החיצוני, פנימית לאפידרמיס, לדרמיס ולשרירים המעגליים.

בניגוד לתאי השריר, הגנגליונים המרכזיים בצד הוונטרלי של העובריים בשלבים העובריים שבהם אנו עובדים, E7 עד E12, ממוקמים בעומק של כ-50 µm מהפני השטח הוונטרלי של הגוף. נכוון את לחץ ההליום כך שניתמקד בשרירים האורכיים, שניתן למצוא בעומק שטחי יותר מהגנגליונים. כעת אנו מוכנים להפגיז את השרירים האורכיים בחלקיקי זהב.

מנה של חלקיקי זהב במשקל של כחצי מיליגרם יכולה לשמש בדרך כלל לעד 10 יריות, כאשר ירייה אחת מספקת בדרך כלל סדר גודל של כמה מאות חלקיקים. ירייה נוצרת על ידי פתיחה קצרה של אחד השסתומים למשך 0.3 שניות, הגורמת להזרקה של בולוס של חלקיקים מקו הצנרת התואם אל תוך גוף הרובה. כדי לכסות את אזור הרקמה הרלוונטי, נדרשות לעיתים קרובות מספר יריות.

יש להקיש בעדינות על הצינורית בין ההזרקות כדי לשחרר חלק מהחלקיקים ולהקל על הזרקתם אל זרם ההליום הרציף בתוך קנה הרובה. אם ברצונכם להעביר ריאגנט שני באותה בדיקה, ניתן להטעין חלקיקים חלופיים לצינורית שנייה מיד לאחר העברת חלקיקי הזהב. העוברים מוחזרים למי בריכה מלאכותית, רצוי עובר אחד לכל צלחת, למשך יום אחד עד שלושה ימים, עד שביטוי אקטופי או RNAi ייחשבו למספיקים.

במהלך זמן זה, העוברים נשמרים בתא חשוך בטמפרטורת החדר. להלן מבט על בדיקת היברידיזציה של in situ עבור narine, knockdown של Mr.NA. ניתן לראות כי בעובר המטופל, מעט תאי שריר אינם מבטאים terrin.

שרירים אלו מכילים חלקיקים. ניתן לראות שכאשר החלקיקים היו מצופים ב-RNA דו-גדילי של terrin, הם גרמו להשתקה (knockdown) נראית לעין של ביטוי narin, שהתרחשה רק בתאים המכילים חלקיקים, בדרך כלל חלקיק אחד עד שניים לכל תא. כאשר מצפים את החלקיקים בפלסמיד המקודד ל-GFP, מתקבלת פלואורסצנציה בתאי עצב כאשר הם נעצרו בגרעיניהם באמצעות אקדח הקפילריה הפנומטי שבו אנו משתמשים.

בהדגמה זו, הצלחנו להחדיר את שני החלקיקים לתאים בנפח קטן וממוקד של עובר חי, מבלי לגרום לנזק גלוי לתאים באזור המטרה. כמו כן, הצגנו כיצד אקדח הנימים הנוודי (nomadic capillary gun) מעניק טכניקה של הובלה הוליסטית ויכולת חדשה לביצוע knock in ו-knock down של גנים באזור מיקרוסקופי של רקמה המוגבלת בשלושה ממדים ומיועדת בדיוק גבוה, ללא נזק גלוי לרקמה. וזהו זה.

תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.