שיטות לכימות במקום של מורפולוגיית מיטוכונדריה בתאי שריר וסופיים של עכברים
10 באפריל 2026
הזרקות מקומיות של תווית צבע מיטוכונדריאלי סופית של מיטוכונדריה תא שוואן ב-vivo למיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו משתמשת בהוכחת היתכנות שהודגמה ברקמת שריר שלד של עכברים עם שריר בריא או חולה, כדי לספק הדמיה מיטוכונדרית ברזולוציה גבוהה.
המחקר שלנו בוחן לראשונה את המורפולוגיה המיטוכונדריאלית של תאי שוואן הסופיים במפגש הנוירומוסקולרי. הגישה שלנו מאפשרת לכמת את המורפולוגיה המיטוכונדריאלית ברקמות שקשה להשיג, כגון מיטות נימיות ולימפה. כדי להתחיל, קנה עכבר מסוג wild ועכבר D2-mdx.
לאחר אישור עומק ההרדמה באמצעות רפלקס צביטת אצבעות, מכניסים את המחט בגיד הדיסטלי לכיוון הברך הימנית. הזרקו 50 מיקרוליטר של כתם מיטוכונדריאלי אדום באורך שני מיקרומולרים על השריר הפנימי של השוקה, או ה-TA, תוך משיכת המחט לאורך מסלול ההזרקה, ודוגרו את הצבע ב-vivo למשך שעה. בעת שמירה על בעל החיים תחת הרדמה, השתמשו במספריים ומלקחיים כדי לנתח ולבודד את שריר ה-TA לפני המתת חסד.
הניחו את שריר ה-TA המבודד ב-4% פאראפורמלדהיד בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ סטריאו, הפרדו בעדינות את הסיבים על ידי גירוי. הוסיפו צבע חומצה גרעין-תאי ל-4% פאראפורמלדהיד לקבלת ריכוז סופי של חמישה עד עשרה מיקרוגרם למיליליטר לצורך תיוג גרעיני.
לאחר מכן, שטפו את שריר ה-TA שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות כל אחת כדי להסיר צבע עודף. ייבשו את השריר ברצף ב-50%75% ו-100% אתנול במשך חמש דקות כל אחד. לאחר מכן, דגרו את הדגימה ברצף בתמיסות ניקוי רקמות אחת ושתיים למשך 30 דקות כל אחת, כדי לוודא שהן טבולות לחלוטין.
שים את השריר על קוברסליפ. השתמש בבלוק זכוכית בגודל 2.5 על 2 על 1 סנטימטר במשקל 7.8 גרם כדי ליישר אותו בעדינות. קבל עכבר בטא S100.
לאחר אישור עומק ההרדמה באמצעות רפלקס צביטת האצבעות, בצע חתך קטן בעור מעל שריר הישבן מקסימוס, או GM. הזריק 75 מיקרוליטר של כתם מיטוכונדריאלי אדום ואדום באורך שני מיקרומולרים מתחת לשריר ה-GM. סגור את הפצע ותן לצבע לדוגר במשך 45 דקות כדי לסמן באופן סלקטיבי תאי שוואן סופיים.
תוך שמירה על החיה תחת הרדמה, נתח את שריר ה-GM תוך 10 דקות, ומניחים אותו מיד בסליין סטרילי מקורר של 0.9%. רק אם משתמשים בעכברי D2-mdx, הוסיפו צבע קולטני אצטילכולין פלואורסצנטי בדילול של אחד ל-500 לאמבט המיקרודיסקציה, ודגרו את הרקמה למשך 30 דקות. גזמו את השומן העודף ורקמת החיבור, והעבירו את שריר GM לכיסוי עם הצד הגחוני פונה כלפי מטה למיקרוסקופיה הפוכה.
הוסף שני מיקרוליטרים של מדיום התקנה כללי על פני השטח הגבי של GM, ושטח את הרקמה באמצעות בלוק זכוכית לפני ההדמיה. בתוכנה, הגדר את אורך גל העירור ל-646 ננומטר. לאחר הוספת שתי טיפות של תמיסת ניקוי שתיים, בחר את עדשת האובייקטיב 63X כדי לצלם את שריר ה-TA, והגדר את עומק ערימת ה-Z קרוב ל-100 מיקרומטר.
לאחר מכן, בחר במצב דה-קונבולוציה, ומיישם פרמטרים מותאמים למערכת. הגדר את גודל הצעד למיקרומטר אחד וצלם תמונות. כדי לרכוש תמונות של תאי שוואן בטרמינל, בחרו את עדשת האובייקטיב בהגדלה פי 20, הגדרו את עומק ערימת ה-Z לכ-17 מיקרומטרים, וקבלו תמונות.
לאחר מכן, בחר את עדשת המטרה בהגדלה של 63 פעמים וצלם תמונות של תאי שוואן סופיים בודדים. ייבא פרוסות Z בודדות כדי לאמן את התוכנה לזהות את אות המיטוכונדריה. ולבצע ניתוח כמותי באמצעות תוכנה מבוססת בינה מלאכותית.
פתח מסכות תמונה לסקירת חוקרים. הפרדת ערימות תמונות תלת-ממדיות לחלקים אופטיים נפרדים לפי אופטימיזציה של אלגוריתם. בחר כל פרוסת Z חמישית מכל תמונה תלת-ממדית, וחשב את הממוצע לדגימה.
לאחד את פרמטרי ההדמיה בכל הדגימות, ולכמת את המורפולוגיה המיטוכונדרית. לבצע אימונוהיסטוכימיה וניתוח סטטיסטי להערכת הבדלים וקורלציות קבוצתיות. הקישוריות המיטוכונדריאלית הופחתה בשריר mdx בהשוואה לעכברים מסוג בר.
נצפה מספר גדול יותר של שברי מיטוכונדריה קטנים ומספר מופחת של רשתות מיטוכונדריאליות גדולות ומקושרות בעכברי MDX. בעכברים מסוג פראי, מיטוכונדריה בתאי שוואן סופיים הראו מבני לולאה מקושרים סמוך לפיצולים. לעומת זאת, בעכברי mdx, המיטוכונדריה נראתה מפורקת וחסרה תצורות לולאה סמוך לפיצולים.
מיקרוסקופיה קונפוקלית ומיקרוסקופית אלקטרונית אישרה מבנים מיטוכונדריאליים דומים בצורת סופגניה בתאי שוואן סופיים. ניתוח פוסט-סינפטי הראה שמיטוכונדריה תת-סרקולמלית התקבצו סביב קולטני אצטילכולין, ללא מבנה דמוי בייגלה אופייני. ניתוח תמונה גילה כי מיטוכונדריה של תאי שוואן הסופיים בשריר MDX הראו שטח ופיצול מוגברים לעומת שריר מסוג פראי, ללא הבדל בגודל החלקיקים היחסי.
מדידות כוח שריר הראו ירידה בעווית עם שונות גדולה יותר וירידה בכוח השיא בשריר MDX. ייצור כוח בתדרי גירוי הולכים וגדלים גם הוא הופחת משמעותית בשרירי MDX. שריר ה-mdx הראה הזזה שמאלה בגודל הסיבים, מה שמעיד על כ-60% מהשריר המיוסיבי הקטן יותר בהשוואה לסוג פראי.
פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לחקור ולכמת את המורפולוגיה המיטוכונדריאלית בשריר השלד ובתאי שוואן הסופיים. מחקרים עתידיים יוכלו להתאים גישה זו לחקר מורפולוגיית מיטוכונדריה במיקרו-סירקולציה ובכלי לימפה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מציג שיטה הניתנת לשחזור לסימון וכמות של מורפולוגיית רשת מיטוכונדריאלית תלת-ממדית בשריר שלד בשיטת whole-mount ובתאי שוואן טרמינליים (tSCs) בעכברים. באמצעות הובלה in vivo של צבע מיטוכונדריאלי הרגיש לפוטנציאל ממברנה ומיקרוסקופיה קונפוקלית סטנדרטית, גישה זו מאפשרת ניתוח מפורט של הארכיטקטורה המיטוכונדריאלית בתוך רקמות עצביות-שריריות שלמות, ובכך היא מתגברת על אתגרים הקשורים להרס רקמות ולמורכבות אנטומית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצבים תאיים ומולקולריים
- ביולוגיה של השריר
- דימות ומיקרוסקופיה
רקע
- מורפולוגיה של הרשת המיטוכונדריאלית היא מדד מרכזי לבריאות התא.
- כימות של הארכיטקטורה המיטוכונדריאלית ברקמות שלמות הוא מאתגר מבחינה טכנית.
- תאי שוואן טרמינליים (tSCs) קריטיים לתחזוקה ולהתחדשות של הצומת העצבי-שרירי.
- ניתוח של tSCs במצבם המקורי (in situ) הוא קשה בשל מיקומם ורגישותם להרס רקמתי.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול הניתן לשחזור לסימון וכימות של מורפולוגיה מיטוכונדריאלית בשריר שלד בשיטת whole-mount ובתאי tSCs.
- מתן אפשרות לניתוח רשתות מיטוכונדריאליות in situ ללא צורך במדווחים טרנסגניים או בפלטפורמות דימות מיוחדות.
- תיקוף השיטה הן ברקמת שריר בריאה והן ברקמת שריר דיסטרופית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- החדרה in vivo של צבע מיטוכונדריאלי הרגיש לפוטנציאל ממברנה.
- עיבוד מהיר של רקמות לשמירה על המבנה המיטוכונדריאלי.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה להדמיה תלת-ממדית.
- ניתוח ערימות תמונות לכימות קישוריות הרשת המיטוכונדריאלית, השטח והפרגמנטציה.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מסמן ומכמת בהצלחה רשתות מיטוכונדריאליות בשריר שלד בשיטת whole-mount ובתאי tSCs.
- תיקוף בשריר דיסטרופי ובשריר בריא מאשר את ההבדלים הצפויים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית.
- השיטה ניתנת להסתגלות ל-tSCs באמצעות עכברי reporter עבור S100β.
- ניתן לבצע את הניתוח באמצעות ציוד הזמין בדרך כלל במעבדות ליבה אוניברסיטאיות.
מסקנות
- גישה זו מאפשרת ניתוח מפורט של מורפולוגיית המיטוכונדריה ברקמות עצביות-שריריות שלמות.
- היא מבטלת את הצורך במדווחים מיטוכונדריאליים טרנסגניים או בפלטפורמות דימות ייעודיות.
- הפרוטוקול ניתן להתאמה לרקמות דקות אחרות או כאלה הנגישות באופן שטחי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
ניתוח כמותי in situ של מורפולוגיית מיטוכונדריה בשרירים ובתאי שוואן טרמינליים נותן מענה לפער קריטי בשלבי הגילוי המוקדמים ובתיקוף מטרות למחקר של מחלות נוירו-מוסקולריות ומטבוליות. פרוטוקול זה מאפשר הערכה בעלת תוכן גבוה וניתנת לשחזור של שלמות רשת המיטוכונדריה בתוך רקמות שלמות, ובכך תומך בביטחון ניבוי במודלים רלוונטיים למחלה ומסייע בקבלת החלטות בתיק השקעות מותאמות סיכונים. התאימות שלו לתשתיות דימיון סטנדרטיות משפרת את הנגישות והיכולת להרחבה בקרב צוותי מו"פ.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של בריאות הרשת המיטוכונדריאלית בסביבות רקמה רלוונטיות פיזיולוגית.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי כימות קישוריות הרשת, השטח והפרגמנטציה במודלים של מחלה ובביקורות.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבחנה בין פנוטיפים מיטוכונדריאליים בשריר בריא לעומת שריר דיסטרופי.
- מספק נקודות קצה כמותיות לניתוח מסלולים מונחה-היפותזה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מבסס זרימות עבודה (workflows) מאומתות של דימוי וכימות עבור מורפולוגיה מיטוכונדריאלית ברקמות שלמות (whole-mount).
- מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור, המתאימות לסטנדרטיזציה של בדיקות ולהשוואה בין מחקרים.
- מאפשר סריקה של התערבויות המשפיעות על דינמיקה מיטוכונדריאלית במערכות רקמה נגישות.
- תומכת בשימוש חוזר בפלטפורמה עבור סוגי רקמות מרובים, ללא הסתמכות על דוחות טרנסגניים (transgenic reporters).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאם נקודות קצה של מורפולוגיה מיטוכונדריאלית עם הקשרי רקמה הרלוונטיים למחלה לצורך פיתוח של סמנים ביולוגיים תרגומיים.
- שומר על רצף משלב הגילוי ועד לאימות פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לניתוח הן בתאי שריר והן בתאי שוואן (Schwann cells).
- מספק נתונים מותאמי סיכון להכוונת קידומם של טיפולים המכוונים למיטוכונדריה.
- מאפשר התאמה לרקמות דקות נוספות או לרקמות הנגישות באופן שטחי, לצורך השפעה תרגומית רחבה יותר.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף השלב שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי כך שהיא מאפשרת כימות חסון של מורפולוגיה מיטוכונדריאלית ברקמות שלמות, ובכך היא תומכת הן בתיקוף יעדים מוקדם והן במחקר תרגומי המשכי.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובהסרת סיכונים מנגנונית באמצעות מדידה ישירה של מאפייני הרשת המיטוכונדריאלית.
- סריקה: מספק פלטי דימות כמותיים וסטנדרטיים לפיתוח בדיקות ולהערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק מדדי קישוריות רשת, שטח ופרגמנטציה לצורך ניתוח השוואתי בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מגשר בין שלבי הגילוי לשלבים הפרה-קליניים על ידי מתן אפשרות להתאמת סמנים ביולוגיים ברקמות רלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע סבב עבודה בעל התאמה רחבה, התואם פלטפורמות סטנדרטיות של מיקרוסקופיה קונפוקלית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בניבוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר מיטוכונדריאלי.
- ערך תפעולי: מקדם שחזור ויכולת התרחבות (scalability) באמצעות תשתיות דימות זמינות ונפוצות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות go/no-go ואת יעילות ההון על ידי אספקת נקודות סיום (endpoints) כמותיות וחסונות.
- השפעה על תיק הפעילות: תומך בתיעדוף מותאם סיכון של תוכניות המכוונות למיטוכונדריה על פני תחומי מחלה שונים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה קונפוקלית ובניתוח כמותי של תמונות.
- עושה שימוש בצבעים סטנדרטיים הרגישים לפוטנציאל ממברנה ובפלטפורמות דימוג הנפוצות במעבדות מרכזיות (core facilities).
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי עיבוד רקמות ודימוג לצורך השחזרות.
- ניתן להתאמה לרקמות דקות אחרות או לרקמות הנגישות באופן שטחי עם שינויים מינימליים בפרוטוקול.
- תלוי בנגישות הרקמה ובתאימות הצבע לקבלת תוצאות אופטימליות.
