שיטות לכימות במקום של מורפולוגיית מיטוכונדריה בתאי שריר וסופיים של עכברים
10 באפריל 2026
הזרקות מקומיות של תווית צבע מיטוכונדריאלי סופית של מיטוכונדריה תא שוואן ב-vivo למיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו משתמשת בהוכחת היתכנות שהודגמה ברקמת שריר שלד של עכברים עם שריר בריא או חולה, כדי לספק הדמיה מיטוכונדרית ברזולוציה גבוהה.
המחקר שלנו בוחן לראשונה את המורפולוגיה המיטוכונדריאלית של תאי שוואן הסופיים במפגש הנוירומוסקולרי. הגישה שלנו מאפשרת לכמת את המורפולוגיה המיטוכונדריאלית ברקמות שקשה להשיג, כגון מיטות נימיות ולימפה. כדי להתחיל, קנה עכבר מסוג wild ועכבר D2-mdx.
לאחר אישור עומק ההרדמה באמצעות רפלקס צביטת אצבעות, מכניסים את המחט בגיד הדיסטלי לכיוון הברך הימנית. הזרקו 50 מיקרוליטר של כתם מיטוכונדריאלי אדום באורך שני מיקרומולרים על השריר הפנימי של השוקה, או ה-TA, תוך משיכת המחט לאורך מסלול ההזרקה, ודוגרו את הצבע ב-vivo למשך שעה. בעת שמירה על בעל החיים תחת הרדמה, השתמשו במספריים ומלקחיים כדי לנתח ולבודד את שריר ה-TA לפני המתת חסד.
הניחו את שריר ה-TA המבודד ב-4% פאראפורמלדהיד בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ סטריאו, הפרדו בעדינות את הסיבים על ידי גירוי. הוסיפו צבע חומצה גרעין-תאי ל-4% פאראפורמלדהיד לקבלת ריכוז סופי של חמישה עד עשרה מיקרוגרם למיליליטר לצורך תיוג גרעיני.
לאחר מכן, שטפו את שריר ה-TA שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות כל אחת כדי להסיר צבע עודף. ייבשו את השריר ברצף ב-50%75% ו-100% אתנול במשך חמש דקות כל אחד. לאחר מכן, דגרו את הדגימה ברצף בתמיסות ניקוי רקמות אחת ושתיים למשך 30 דקות כל אחת, כדי לוודא שהן טבולות לחלוטין.
שים את השריר על קוברסליפ. השתמש בבלוק זכוכית בגודל 2.5 על 2 על 1 סנטימטר במשקל 7.8 גרם כדי ליישר אותו בעדינות. קבל עכבר בטא S100.
לאחר אישור עומק ההרדמה באמצעות רפלקס צביטת האצבעות, בצע חתך קטן בעור מעל שריר הישבן מקסימוס, או GM. הזריק 75 מיקרוליטר של כתם מיטוכונדריאלי אדום ואדום באורך שני מיקרומולרים מתחת לשריר ה-GM. סגור את הפצע ותן לצבע לדוגר במשך 45 דקות כדי לסמן באופן סלקטיבי תאי שוואן סופיים.
תוך שמירה על החיה תחת הרדמה, נתח את שריר ה-GM תוך 10 דקות, ומניחים אותו מיד בסליין סטרילי מקורר של 0.9%. רק אם משתמשים בעכברי D2-mdx, הוסיפו צבע קולטני אצטילכולין פלואורסצנטי בדילול של אחד ל-500 לאמבט המיקרודיסקציה, ודגרו את הרקמה למשך 30 דקות. גזמו את השומן העודף ורקמת החיבור, והעבירו את שריר GM לכיסוי עם הצד הגחוני פונה כלפי מטה למיקרוסקופיה הפוכה.
הוסף שני מיקרוליטרים של מדיום התקנה כללי על פני השטח הגבי של GM, ושטח את הרקמה באמצעות בלוק זכוכית לפני ההדמיה. בתוכנה, הגדר את אורך גל העירור ל-646 ננומטר. לאחר הוספת שתי טיפות של תמיסת ניקוי שתיים, בחר את עדשת האובייקטיב 63X כדי לצלם את שריר ה-TA, והגדר את עומק ערימת ה-Z קרוב ל-100 מיקרומטר.
לאחר מכן, בחר במצב דה-קונבולוציה, ומיישם פרמטרים מותאמים למערכת. הגדר את גודל הצעד למיקרומטר אחד וצלם תמונות. כדי לרכוש תמונות של תאי שוואן בטרמינל, בחרו את עדשת האובייקטיב בהגדלה פי 20, הגדרו את עומק ערימת ה-Z לכ-17 מיקרומטרים, וקבלו תמונות.
לאחר מכן, בחר את עדשת המטרה בהגדלה של 63 פעמים וצלם תמונות של תאי שוואן סופיים בודדים. ייבא פרוסות Z בודדות כדי לאמן את התוכנה לזהות את אות המיטוכונדריה. ולבצע ניתוח כמותי באמצעות תוכנה מבוססת בינה מלאכותית.
פתח מסכות תמונה לסקירת חוקרים. הפרדת ערימות תמונות תלת-ממדיות לחלקים אופטיים נפרדים לפי אופטימיזציה של אלגוריתם. בחר כל פרוסת Z חמישית מכל תמונה תלת-ממדית, וחשב את הממוצע לדגימה.
לאחד את פרמטרי ההדמיה בכל הדגימות, ולכמת את המורפולוגיה המיטוכונדרית. לבצע אימונוהיסטוכימיה וניתוח סטטיסטי להערכת הבדלים וקורלציות קבוצתיות. הקישוריות המיטוכונדריאלית הופחתה בשריר mdx בהשוואה לעכברים מסוג בר.
נצפה מספר גדול יותר של שברי מיטוכונדריה קטנים ומספר מופחת של רשתות מיטוכונדריאליות גדולות ומקושרות בעכברי MDX. בעכברים מסוג פראי, מיטוכונדריה בתאי שוואן סופיים הראו מבני לולאה מקושרים סמוך לפיצולים. לעומת זאת, בעכברי mdx, המיטוכונדריה נראתה מפורקת וחסרה תצורות לולאה סמוך לפיצולים.
מיקרוסקופיה קונפוקלית ומיקרוסקופית אלקטרונית אישרה מבנים מיטוכונדריאליים דומים בצורת סופגניה בתאי שוואן סופיים. ניתוח פוסט-סינפטי הראה שמיטוכונדריה תת-סרקולמלית התקבצו סביב קולטני אצטילכולין, ללא מבנה דמוי בייגלה אופייני. ניתוח תמונה גילה כי מיטוכונדריה של תאי שוואן הסופיים בשריר MDX הראו שטח ופיצול מוגברים לעומת שריר מסוג פראי, ללא הבדל בגודל החלקיקים היחסי.
מדידות כוח שריר הראו ירידה בעווית עם שונות גדולה יותר וירידה בכוח השיא בשריר MDX. ייצור כוח בתדרי גירוי הולכים וגדלים גם הוא הופחת משמעותית בשרירי MDX. שריר ה-mdx הראה הזזה שמאלה בגודל הסיבים, מה שמעיד על כ-60% מהשריר המיוסיבי הקטן יותר בהשוואה לסוג פראי.
פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לחקור ולכמת את המורפולוגיה המיטוכונדריאלית בשריר השלד ובתאי שוואן הסופיים. מחקרים עתידיים יוכלו להתאים גישה זו לחקר מורפולוגיית מיטוכונדריה במיקרו-סירקולציה ובכלי לימפה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
Overview
This protocol presents a reproducible method for labeling and quantifying three-dimensional mitochondrial network morphology in whole-mount skeletal muscle and terminal Schwann cells (tSCs) in mice. Utilizing in vivo delivery of a membrane potential–sensitive mitochondrial dye and standard confocal microscopy, the approach enables detailed analysis of mitochondrial architecture within intact neuromuscular tissues, overcoming challenges associated with tissue disruption and anatomical complexity.
Key Study Components
Area of Science
- Cellular and molecular neuroscience
- Muscle biology
- Imaging and microscopy
Background
- Mitochondrial network morphology is a key indicator of cellular health.
- Quantifying mitochondrial architecture in intact tissues is technically challenging.
- Terminal Schwann cells (tSCs) are critical for neuromuscular junction maintenance and regeneration.
- tSCs are difficult to analyze in situ due to their location and sensitivity to tissue disruption.
Purpose of Study
- To develop a reproducible protocol for labeling and quantifying mitochondrial morphology in whole-mount skeletal muscle and tSCs.
- To enable analysis of mitochondrial networks in situ without the need for transgenic reporters or specialized imaging platforms.
- To validate the method in both healthy and dystrophic muscle tissue.
Methods Used
- In vivo delivery of a membrane potential–sensitive mitochondrial dye.
- Rapid tissue processing to preserve mitochondrial structure.
- High-resolution confocal microscopy for three-dimensional imaging.
- Image stack analysis to quantify mitochondrial network connectivity, area, and fragmentation.
Main Results
- The protocol successfully labels and quantifies mitochondrial networks in whole-mount skeletal muscle and tSCs.
- Validation in dystrophic and healthy muscle confirms expected differences in mitochondrial morphology.
- The method is adaptable to tSCs using S100β reporter mice.
- Analysis can be performed using equipment commonly available in university core facilities.
Conclusions
- This approach enables detailed analysis of mitochondrial morphology in intact neuromuscular tissues.
- It eliminates the need for transgenic mitochondrial reporters or specialized imaging platforms.
- The protocol is adaptable to other thin or superficially accessible tissues.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Quantitative in situ analysis of mitochondrial morphology in muscle and terminal Schwann cells addresses a critical gap in early discovery and target validation for neuromuscular and metabolic disease research. This protocol enables high-content, reproducible assessment of mitochondrial network integrity within intact tissues, supporting predictive confidence in disease-relevant models and facilitating risk-adjusted portfolio decisions. Its compatibility with standard imaging infrastructure enhances accessibility and scalability across R&D teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of mitochondrial network health in physiologically relevant tissue environments.
- Supports functional target validation by quantifying network connectivity, area, and fragmentation in disease and control models.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing mitochondrial phenotypes in healthy versus dystrophic muscle.
- Provides quantitative endpoints for hypothesis-driven pathway analysis.
Screening & Assay Development
- Establishes validated imaging and quantification workflows for mitochondrial morphology in whole-mount tissues.
- Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for assay standardization and cross-study comparison.
- Enables screening of interventions affecting mitochondrial dynamics in accessible tissue systems.
- Supports platform reuse across multiple tissue types without reliance on transgenic reporters.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial morphology endpoints with disease-relevant tissue contexts for translational biomarker development.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling analysis in both muscle and Schwann cells.
- Provides risk-adjusted data to inform advancement of mitochondrial-targeted therapeutics.
- Facilitates adaptation to additional thin or superficially accessible tissues for broader translational impact.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust mitochondrial morphology quantification in intact tissues, supporting both early target validation and downstream translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic de-risking through direct measurement of mitochondrial network features.
- Screening: Provides standardized, quantitative imaging outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers network connectivity, area, and fragmentation metrics for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by enabling biomarker alignment in disease-relevant tissues.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly adaptable workflow compatible with standard confocal microscopy platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial research.
- Operational Value: Promotes reproducibility and scalability using widely available imaging infrastructure.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust, quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of mitochondrial-targeted programs across disease areas.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and quantitative image analysis.
- Utilizes standard membrane potential–sensitive dyes and imaging platforms common to core facilities.
- Demands cross-team standardization of tissue processing and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptable to other thin or superficially accessible tissues with minimal protocol modification.
- Dependent on tissue accessibility and dye compatibility for optimal results.
