בידוד פריציטים מרקמת קורטיקת העכבר באמצעות FACS לצורך ריצוף תא יחיד
30 בינואר 2026
כדי להשיג פריציטים קורטיקליים במוח העכבר העומדים בדרישות scRNA-seq, אנו מציגים פרוטוקול FACS מותאם באופן קריטי המבוסס על בחירת CD13⁺/CD31⁻. השיפורים המרכזיים שלנו משפרים משמעותית את חיוניות התא ואת שלמות ה-RNA, ומאפשרים פרופיל טרנסקריפטומי אמין.
המחקר שלנו בוחן טפילי מוח המתמקדים בתפקידיהם הוסקולריים ובאינטראקציות שלהם בתוך היחידה הנוירווסקולרית כדי להבין את תפקוד המוח. הדמיה נמוכה וה-FACS המרחבי במיפוי תהליך המעי או תפקוד הטפיל בתוך כלי דם מוחיים, החושפים את התפקידים הספציפיים למיקום ואת המטרות הטיפוליות. כדי להתחיל, רססו את אזור הראש והצוואר של עכבר שהושמד ב-75% אתנול.
באמצעות סכין מנתח, בצע חתך בקו אמצעי בקרקפת מהעורף לאזור המצחי כדי לחשוף את הגולגולת. מבצעים חתך רוחבי קדמי למסלולים הדו-צדדיים, ואחריו חתכים צדדיים לאורך השוליים התחתונים של המוחון כדי לנתק את בסיס הגולגולת. חתך את הקלווריום לאורך התפר הסגיטלי מהאחורי לקדמי.
הרימו את הדש הגולגולתי יחד עם דורמאטר כדי לחשוף את המוח. באמצעות מספריים כירורגיים, הרימו בעדינות את המוח תוך ניתוק עצבי הראייה וחיבור חוט השדרה של המדולה אובלונגטה. הנח את המוח השלם בעדינות בצלחת בגודל 10 סנטימטר המכילה 10 מיליליטר של PBS קר כקרח, כדי למנוע נזק.
להעביר את המוח לנייר אלומיניום. חשפו את המרחב התת-עכבישי. לאחר הסרת הדורה עם מלקחיים, שטוף אותו עם תמיסת מלח מאוזנת של האנק.
העבר את הטישו לנייר סינון והסר את הפימטר על ידי גלגול. בעזרת להב גילוח, חתכו והשליכו את הבורה הריחנית, ואת רוב חלקי הזנב, וחתכו את המוח לפרוסות בעובי שניים עד שלושה מילימטרים. בודדו את הקורטקס המוחי לאורך הקורפוס הקלוסום.
העבר את רקמת הקורטקס לאמפלות המכילות שלושה מיליליטרים של בופר לאיסוף רקמות קר. באמצעות סכינים כירורגיים, טחנו את הרקמה והאמפולות לחתיכות של כ-1 על 1 מילימטר, והשלים את הטחינה תוך חמש דקות כדי לשמור על טריות הרקמה. שטוף מראש את קצות הפיפטה עם בופר איסוף רקמות.
לאחר מכן שאף לאט את השברים הקצוצים לכיוון קצה הקצה תוך כדי החזקת הפיפטה אנכית. הוצא בעדינות את השברים לצינורות צנטריפוגה מקוררים מראש בנפח 15 מיליליטר. שטוף את האמפולות המקוריות עם 2% FBS במי מלח PBS.
העבר את השטיפה לאותם צינורות צנטריפוגה ולצנטריפוגה בטמפרטורה של 300G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. להשליך את הסופרנטנט לאחר הצנטריפוגה. תלו מחדש כל כדור בשלושה מיליליטר של תמיסת אנזימי CD.
מחלקים את המתלה באופן שווה לשלושה צינורות, ומוסיפים תמיסת אנזימים נוספת כדי להגיע לנפח סופי של חמישה מיליליטר לכל צינור. דגרו את הצינורות בתנור היברידיזציה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 100 דקות עם ניעור מסלול ב-100G. במהלך הדגירה, הוסף מיליליטר אחד של דנאז תמיסה אחת ל-10 מיליליטר של 2% FBS ב-PBS.
סיימו את העיכול על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 300G בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן תלו מחדש כל כדור במיליליטר אחד של תמיסת ניתוק רקמה. פיפט את הפתרון 100 פעמים כדי לסייע בדיסוציאציה מכנית.
לאחר מכן, אסוף את כל המתלים לצינור צנטריפוגה אחד בנפח 50 מיליליטר. שטוף כל צינור עם שני מיליליטרים של בופר וערבב את השטיפה. לאחר צנטריפוגה ב-300G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס והשלכת השכבה העליונה, הוסף 12.5 מיליליטר של 20% BSA והפך לערבוב.
צנטריפוגה ב-1000 גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. עכשיו אסוף את הכדור התחתון והעבר את הסופרנטנט לצינור צנטריפוגה חדש בנפח 50 מיליליטר. השעתי בעדינות לפני שצנטריפוגה שוב.
תלה מחדש כל כדור בשני מיליליטרים של 2% FBS ב-PBS. ואז משלבים את שני המתלים לצינור אחד. צנטריפוגה את המתלים המשולבים ב-300G בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.
לאחר השלכת הסופרנטנט, תלה מחדש את הכדור האחרון בשני מיליליטר PBS עם 2% FBS. הכינו ארבעה צינורות צנטריפוגה בנפח 15 מיליליטר המכילות ארבעה מיליליטרים של 22% לכל תמיסת קריאה. שכב בעדינות אליקוטים של 0.5 מיליליטר של תליית התא על כל גרדיאנט וצנטריפוגה בטמפרטורה של 560G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר שאיפת הסופרנאנט, הרחקו מחדש כל כדור במיליליטר אחד של בופר גלוקוז BSA. אחר כך מושך את המתלים לצינור חדש בנפח 15 מיליליטר. שטפו את צינורות הפרקול עם שני מיליליטרים של בופר וערבבו את השטיפות לפני הצנטריפוגה ב-300 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לצורך ציטומטריית זרימה, יש להשעות מחדש את הכדור במיליליטר אחד של בופר גלוקוז HBSS BSA לאחר שאיפת הסופרנדנט. הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של תגובת חסימת קולטני FC ודגרו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן פיפטה יצרה נוגדנים פלואורסצנטיים למתנגד לפני הדגירה.
שטוף את התאים עם שישה מיליליטרים של בופר גלוקוז HBSS BSA. לאחר מכן צנטריפוגה את המתלה ב-300G בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר שאיפת הסופרנאנט, תלו מחדש את הכדור במיליליטר אחד של בופר.
הוסף 200 מיקרוליטר של שבעה תמיסת אמינו אקטינומיצין D ודגר על קרח למשך 10 דקות. לאחר מכן כוון את הנפח הסופי לשני מיליליטר עם בופר HBSS בתוספת BSA וגלוקוז. שטוף את הפנים של צינורות איסוף המיון בתמיסת 1% BSA.
שואבים את התמיסה העודפת, והשאירו בדיוק מיליליטר אחד של תמיסה בכל צינור. אחסן את הצינורות על קרח כדי לקבל תאים ממוינים. תאים שהתנתקו מרקמת המוח הוגדרו ברצף על ידי אזור פיזור קדמי ואזור פיזור צדדי כדי להוציא פסולת תאית במהלך מיון ציטומטריית זרימה.
אירועים חיוביים ל-CD45 ו-CD41 חיוביים ב-41 הופעלו לצורך הסרת תאים המטופואטיים ומזהמים בטסיות. תאי דופן כלי דם חיוביים ב-CD13 הועשרו. ותאי אפופטוטיה הוצאו באמצעות שבעה גייטינג שלילי של אמינו אקטינומיצין D, ואחריהם סלקציה שלילית CD31 לבידוד טפילים.
מיון ציטומטריית זרימה הראה שתאים גרעיניים אחראים ל-59.8% מכלל האירועים. תאים חיוביים ב-CD13 היוו 1% מכלל האירועים. ואוכלוסיית הטפילים השליליים החיוביים ל-CD13 הסופית היוותה 0.7% מכלל האירועים.
הפחתת ממדיות UMAP של התאים הממוינים חשפה שישה אשכולות עיקריים מובחנים המצביעים על הטרוגניות תאית בתוך האוכלוסייה המבודדת. ניתוח מפת חום מנורמלת בציון Z הראה כי גני סמן טפילים מבוטאים באופן גבוה ובעיקר באשכולות אפס עד שלוש. ניתוח פרופורציות אשכולות הראה כי אשכולות מאפס עד שלוש מהווים 87.1% מסך האוכלוסייה.
בעוד שסמני תאי שריר חלק הועשרו באשכול ארבע ב-10.14% וסמנים של פיברובלסטים הועשרו באשכול החמישי ב-2.77%. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לבודד טפילים לבישים בטוהר גבוה המתאימים לריצוף תאים בודדים ולניתוח תפקודי במורד הזרם. האתגר המרכזי הוא היעדר סמנים טפילים ספציפיים מאוד, בידוד מסובך, והסיכון המוגבר לזיהום חילוני. מחקרים עתידיים יכולים להתמקד בזיהוי סמנים ספציפיים לטפילים, לאפשר שיפור בידוד, אפיון פונקציונלי עמוק יותר וחקירות טיפוליות ממוקדות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול אופטימלי וניתן לשחזור לבידוד פריסייטים (pericytes) ממוח של עכבר, המתאים לרצף RNA של תא בודד (scRNA-seq). באמצעות זיקוק של אסטרטגיית המיון המקובלת של CD13+/CD31- והחדרת שיפורים מרכזיים, השיטה מאפשרת בידוד חסון של פריסייטים חיים, ובכך מקלה על חקר ההטרוגניות שלהם ותפקידיהם במחלות נוירו-וסקולריות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה של כלי הדם
רקע
- פריציטים חיוניים לשמירה על שלמות מחסום הדם-מוח.
- הם מווסתים את ההומאוסטזיס ההמודינמי המוחי על ידי מודולציה של טון המיקרווסקולרי.
- תפקוד לקוי של פריציטים קשור להפרעות נוירולוגיות שונות.
- הבנת ההטרוגניות של הפריציטים היא קריטית להבהרת תפקידם במחלות נוירווסקולריות.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול אופטימלי לבידוד פריציטים ממוח של עכבר המתאים ל-scRNA-seq.
- מתן אפשרות לניתוח באיכות גבוהה של תאי בודדים לבחינת ההטרוגניות של הפריציטים.
- אספקת כלי לחקירת מנגנוני פעולה של פריציטים במחלות נוירו-וסקולריות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הוצאת מוחות מעכברים בוגרים מסוג C57BL/6.
- דיסוציאציה מכנית ועיכול אנזימתי של רקמת המוח להשגת תרחיפי תאים בודדים.
- שלבי סנטריפוגציה רצופים.
- ריסספנסיה של משקע התאים הסופי ב-20% bovine serum albumin (BSA) כדי למזער סטרס ואגרגציה.
- מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS) באמצעות אסטרטגיית CD13+/CD31-.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מניב פריסייטים (pericytes) חיים ממוח של עכבר המתאימים ל-scRNA-seq.
- שימוש ב-20% BSA משפר את חיוניות התאים ואת איכות ה-RNA.
- השיטה היא הדירה (reproducible) וחזקה לבידוד פריסייטים.
- השיטה מאפשרת מחקר מפורט של ההטרוגניות של הפריסייטים ברזולוציה של תא בודד.
מסקנות
- פרוטוקול אופטימלי זה מקל על בידוד איכותי של פריציטים מהמוח של עכבר עבור scRNA-seq.
- הוא מספק כלי בעל ערך לניתוח השונות של הפריציטים ותפקידיהם הפתולוגיים במחלות נוירווסקולריות.
- גישה זו עשויה לקדם את המחקר על מנגנונים הקשורים לפריציטים בהפרעות נוירולוגיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד חסון של פריציטים חיים מרקמת קורטקס של עכבר באמצעות FACS נותן מענה ישיר לצורך בקלטים תאיים בעלי נאמנות גבוהה לגילוי מטרות נוירו-וסקולריות. פרוטוקול זה מגביר את הביטחון החזוי במחקרי רצף RNA של תא בודד על ידי מזעור עקה תאית ושקיעה (aggregation), ובכך תומך באימות מטרות קפדני ובהפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS). גישה זו מאפשרת תהליכי עבודה ניתנים להרחבה ולשחזור, החיוניים למיון תיקי פיתוח ולהמשכיות של מחקר תרגומי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה מדויקת של ההטרוגניות של פריסייטים (pericytes) הרלוונטית למנגנוני מחלות נוירו-וסקולריות.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי אספקת תשומות באיכות גבוהה של תאים בודדים עבור פרופיל טרנסקריפטומי.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנוניים באמצעות בידוד הדיר ביצועים של אוכלוסיות תאים מוגדרות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק אוכלוסיות מאוששות של פריציטים (pericytes) עבור בדיקות של תא בודד (single-cell assays) וסריקה מולקולרית בהמשך התהליך.
- משפר את השחזוריות ואת הסטנדרטיזציה של הבדיקה על ידי מזעור התקבצות תאים ומצבי עקה.
- תומך בקריאות כמותיות החיוניות להערכה אמינה של תרכובות בצינורות עיבוד הממוקדים במערכת העצבים המרכזית (CNS).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם מידול מערכות רלוונטי למחלה על ידי בידוד פריציטים המעורבים בפתולוגיה נוירו-וסקולרית.
- מאפשר המשכיות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות ייצור נתונים באיכות גבוהה ברמת התא הבודד.
- מספק פלטפורמה לזיהוי ביומרקרים תרגומיים הקשורים לתפקוד לקוי של פריציטים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
פרוטוקול זה לבידוד פריסייטים (pericytes) המבוסס על FACS משלב בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר פרה-קליני, ומספק חומר תאי באיכות גבוהה עבור רצף תאים בודדים (single-cell sequencing) ומחקרים פונקציונליים המשכיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים ביולוגיים על ידי אפשור ניתוח טרנסקריפטומי של תאי פריסייטים ברמה של תא בודד.
- סריקה: מספק אוכלוסיות תאים חיוניות וניתנות לשחזור לצורך פיתוח בדיקות וסריקת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק פלטי RNA כמותיים של תאים בודדים לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מסייע בגילוי סמנים ביולוגיים ובבירור מנגנוני מחלה במודלים נוירו-ווסקולריים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס זרימת עבודה סטנדרטית הניתנת להתאמה לסוגי תאים אחרים במערכת העצבים המרכזית (CNS) באמצעות אופטימיזציה של סמנים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות נוירו-וסקולריות.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של תהליכי בידוד תאים בודדים.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך תהליך (go/no-go) ואת יעילות ההון בקידום פורטפוליו של מערכת העצבים המרכזית (CNS).
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של מטרות נוירו-וסקולריות ותוכניות תרגומיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתפעול FACS ובבחירה של סממנים לתאי מערכת העצבים והכלי הדם.
- מחייב גישה לתשתיות איכותיות של ציטומטריה של זרימה וריצוף של תא בודד.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי עיבוד רקמה ומיון תאים.
- עשוי לדרוש התאמה של פאנלי סממנים לסוגי תאים אחרים במערכת העצבים המרכזית או למודלים של מחלות.
- חיוניות התאים ושלמות ה-RNA תלויות בטיפול מדויק ובמניעת אגרגציה באמצעות BSA.
