מיקרודיסקציה בלייזר של רקמת כבד עכבר מקובעת בפרפורמלדהיד לניתוח RNA

המחקר שלנו בוחן בעיקר את הפתופיזיולוגיה הקשורה להפטוציטים בהקשר של מחלות כבד כרוניות. פרוטוקול זה מאפשר בידוד תאים בפרוסות רקמת כבד והפקת RNA. בניגוד ל-FFPE, או פרוטוקול Paraformaldehede-fixed או CT משמר ואיגרט, מה שמאפשר דיון מיקרו מדויק ודגימות איכותיות לניתוח OMI במורד הזרם.

כדי להתחיל לחשוף את ממברנת העט לאור אולטרה סגול ארבע וחצי דקות. ציפוי את הסליידס ב-0.1 מיליגרם למיליליטר של פולי L ליזין ואפשר להם להתייבש באוויר. אוטם את הקצוות של כל סלייד עם מדיום התקנה ניטרלי.

באמצעות חומר ניקוי RNase, נקה את כל המשטחים הנגישים של הקריאוסטט ואת כל הכלים. משתמש ב-75% אתנול. נקה היטב את המברשת ואת הכלים.

עכשיו, כוון את טמפרטורת הקריוסטט למינוס 20 מעלות צלזיוס ותן לה להתייצב. אסוף את דגימות הכבד מאחסון מינוס 80 מעלות צלזיוס. הניחו את הדגימות בתא הקריוסטט לפחות 15 דקות כדי להתאזן.

מרחו שכבה בעובי של תרכובת OCT בעובי שניים עד שלושה מילימטרים על שלב הדגימה. לאחר מכן מניחים את שלב הדגימה על מדף פנוי מהיר או בתוך תא הקריוסטט כדי להתגבש מראש את שכבת התרכובת. לאחר מריחת כמות קטנה של תרכובת OCT על השכבה המוצקה מראש, מניחים את בלוק הרקמה המאוזן אופקית על התרכובת והחזיקו אותו במקום למשך 10 עד 15 שניות.

לאחר מכן התקן את שלב הדגימה עם בלוק הרקמה המחובר לראש דגימת הקריוסטט. עכשיו הכניס את הלהב בזהירות בין לוחות ההידוק ללוחות האחוריים מצד אחד של הקריוסטט. מהדק את ידית ההידוק כדי לאבטח את הלהב.

כוון את עובי הקריוסטט ל-10 מיקרומטר. חתוך את הרקמה לחלקים והתקן אותם ישירות על מחסניות ממברנת העט המטופלות מראש בתוך תא הקריוסטט, נשמר על מינוס 20 מעלות צלזיוס. הפשיר את המגלשות בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.

שטפו את השקופיות שלוש פעמים עם RN ACE PBS חופשי ארבע שניות ו-10 שניות בכל כביסה. הוסיפו את תמיסת ההמטוקסילין המסוננת של מאייר על חלקי הרקמה למשך חמש עד עשר שניות. לאחר מכן שטפו את הסליידים שלוש פעמים במים ללא ריבונוקלאז למשך 10 שניות בכל שטיפה כדי להסיר שאריית המטוקסילין.

הערך את איכות הצביעה תחת מיקרוסקופ. באמצעות נייר סופג, טפחו את הסליידס עד שיתייבשו ותנו להן להתייבש באוויר לחלוטין. נגב את משטח השולחן במעבדה עם חומר ניקוי RNase.

הפעל את הבקר ואפשר למיקרוסקופ להשלים את האתחול. סובב את המפתח בכיוון השעון ממצב כבוי למצב הפעלה כדי להפעיל את מערכת הלייזר. הפעל את המחשב והפעיל את תוכנת לכידת המיקרוסקציה בלייזר.

ואז מחכים שהאתחול יסתיים. כעת הכנס צינור PCR סטרילי בנפח 0.2 מיליליטר למכשיר האיסוף. באמצעות פיפטה, מוסיפים 10 מיקרוליטר של בופר עיכול פרוטאז K למכסה צינור ה-PCR.

טען את מכשיר האיסוף לתוך מחזיק הדגימה במיקרוסקופ. בחלון מכשיר איסוף השינויים. לך לכיוון נקודת ייחוס, כוון את פוקוס המצלמה כדי לראות בבירור את נקודת ההתייחסות והשתמש בבקרות החצים כדי למרכז אותה אם צריך.

טען חתך רקמה לתוך מחזיק הדגימה כשהרקמה פונה כלפי מטה ומיקום התווית מימין. בחר את עדשת האובייקטיב של 10 x וזהה אזורים בעלי עניין עם תכונות פתולוגיות ספציפיות. נווט לתפריט הלייזר.

לחץ על כיול, בחר כן והשלים כיול. בלוח הבקרה של הלייזר, כוון את עוצמת הלייזר ל-50, את הצמצם ל-5 ואת המהירות לתשע. לאחר מכן השתמש בסרגל הכלים הגרפי כדי לצייר עיגול סביב אזור היעד.

בחר צורה אחת, לחץ על התחלה לחתוך כדי ביצוע לכידת לייזר מיקרו-דיסקציה וממקם את מכשיר האיסוף לאיסוף הרקמה שנחתכה. כדי ללכוד תיעוד, תמונות, בחר קובץ ובחר לשמור תמונות לשמירת תמונות לפני ואחרי בפורמט המועדף. לאחר איסוף התאים הרצויים, לחץ על 'פריק' כדי להסיר את הקולקטור מהשלב.

ודאו ש-10 מיקרוליטר של בופר עיכול פרוטאז K נשארים במכסה וממלאים במידת הצורך. סגור את הצינור ועשה עליו מערבולת היטב. אחר כך סובב את הצינור לרגע בצנטריפוגה.

אחסן את הצינור בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד להוצאת ה-RNA. קטע הכבד המוצבע בהמטוקסילין על סלייד העט הוצג תחת מיקרוסקופ לפני ואחרי מיקרודיסקציה בלייזר. אזורים מעניינים המציגים סטיטוזיס מיקרו-וזיקולרי נאספו בדיוק לתוך הכיסוי של צינור PCR.

שמירה על מורפולוגיה תאית שלמה. סך החומצה הריבונוקלאית שהופקה מכ-1000 ו-2000 תאים מבודדים של מיקרודיסקציה בלייזר הניבה 110.7 ננוגרם ו-213.3 ננוגרם בהתאמה. כל הדגימות הראו טוהר גבוה עם יחס ספיגה של 260 על 280 ננומטר בין 1.9 ל-2.1.

אלקטרופורזה בג'ל חשפה רצועות ריבוזיות ריבוזיות מובחנות של 28 שניות ו-18 שניות. פרופילים ביואנליסטיים של חומצה ריבונוקלאית מ-1000 תאים בלבד. נתן מספר שלמות חומצה ריבונוקלאית של 6.7.

Q-R-T-P-C-R עבור גן הניקיון בטא אקטין הניב ערכי סף מחזור שנעים בין 17 ל-19. הערכת ביואנלייזרים של ספריות ריצוף שנבנו מ-50 ננוגרם של חומצה ריבונוקלאית כוללת הראתה שיא אופייני בין 300 ל-500 זוגות בסיסים. ריצוף RNA של ספריות אלו הניב נתונים באיכות גבוהה עם ציוני Q 20 ו-Q 30, מעל 90% ושיעור שגיאה נמוך בכל השכפולים.

שיקול חשוב הוא מניעת התפרקות באמצעות הפסקת בקרה, צביעה מהירה ותנאים ישרים בתהליך העיבוד. הזמנת הליך זה יכולה לשמש ל-PCR בזמן אמת ולרצף עם מפתחות ספרייה מותאמים לפרגמנטציה. מבוסס בדגימות כבד.

פרוטוקול זה מאפשר פרופילינג של תת-קבוצות הפטוציטים ותומך במחקר הפטולוגיה ממוקד בפתולוגיה.