מיקרודיסקציה בלייזר של רקמת כבד עכבר מקובעת בפרפורמלדהיד לניתוח RNA
April 17th, 2026
פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד RNA מאזורים היסטולוגיים מוגדרים של רקמת כבד עכבר, המוטמעת בטמפרטורת חיתוך אופטימלית בטמפרטורת חיתוך אופטימלית באמצעות מיקרודיסקציה ללכידת לייזר, המאפשרת ניתוח ביטוי גנים ממוקד במורד הזרם.
המחקר שלנו בוחן בעיקר את הפתופיזיולוגיה הקשורה להפטוציטים בהקשר של מחלות כבד כרוניות. פרוטוקול זה מאפשר בידוד תאים בפרוסות רקמת כבד והפקת RNA. בניגוד ל-FFPE, או פרוטוקול Paraformaldehede-fixed או CT משמר ואיגרט, מה שמאפשר דיון מיקרו מדויק ודגימות איכותיות לניתוח OMI במורד הזרם.
כדי להתחיל לחשוף את ממברנת העט לאור אולטרה סגול ארבע וחצי דקות. ציפוי את הסליידס ב-0.1 מיליגרם למיליליטר של פולי L ליזין ואפשר להם להתייבש באוויר. אוטם את הקצוות של כל סלייד עם מדיום התקנה ניטרלי.
באמצעות חומר ניקוי RNase, נקה את כל המשטחים הנגישים של הקריאוסטט ואת כל הכלים. משתמש ב-75% אתנול. נקה היטב את המברשת ואת הכלים.
עכשיו, כוון את טמפרטורת הקריוסטט למינוס 20 מעלות צלזיוס ותן לה להתייצב. אסוף את דגימות הכבד מאחסון מינוס 80 מעלות צלזיוס. הניחו את הדגימות בתא הקריוסטט לפחות 15 דקות כדי להתאזן.
מרחו שכבה בעובי של תרכובת OCT בעובי שניים עד שלושה מילימטרים על שלב הדגימה. לאחר מכן מניחים את שלב הדגימה על מדף פנוי מהיר או בתוך תא הקריוסטט כדי להתגבש מראש את שכבת התרכובת. לאחר מריחת כמות קטנה של תרכובת OCT על השכבה המוצקה מראש, מניחים את בלוק הרקמה המאוזן אופקית על התרכובת והחזיקו אותו במקום למשך 10 עד 15 שניות.
לאחר מכן התקן את שלב הדגימה עם בלוק הרקמה המחובר לראש דגימת הקריוסטט. עכשיו הכניס את הלהב בזהירות בין לוחות ההידוק ללוחות האחוריים מצד אחד של הקריוסטט. מהדק את ידית ההידוק כדי לאבטח את הלהב.
כוון את עובי הקריוסטט ל-10 מיקרומטר. חתוך את הרקמה לחלקים והתקן אותם ישירות על מחסניות ממברנת העט המטופלות מראש בתוך תא הקריוסטט, נשמר על מינוס 20 מעלות צלזיוס. הפשיר את המגלשות בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
שטפו את השקופיות שלוש פעמים עם RN ACE PBS חופשי ארבע שניות ו-10 שניות בכל כביסה. הוסיפו את תמיסת ההמטוקסילין המסוננת של מאייר על חלקי הרקמה למשך חמש עד עשר שניות. לאחר מכן שטפו את הסליידים שלוש פעמים במים ללא ריבונוקלאז למשך 10 שניות בכל שטיפה כדי להסיר שאריית המטוקסילין.
הערך את איכות הצביעה תחת מיקרוסקופ. באמצעות נייר סופג, טפחו את הסליידס עד שיתייבשו ותנו להן להתייבש באוויר לחלוטין. נגב את משטח השולחן במעבדה עם חומר ניקוי RNase.
הפעל את הבקר ואפשר למיקרוסקופ להשלים את האתחול. סובב את המפתח בכיוון השעון ממצב כבוי למצב הפעלה כדי להפעיל את מערכת הלייזר. הפעל את המחשב והפעיל את תוכנת לכידת המיקרוסקציה בלייזר.
ואז מחכים שהאתחול יסתיים. כעת הכנס צינור PCR סטרילי בנפח 0.2 מיליליטר למכשיר האיסוף. באמצעות פיפטה, מוסיפים 10 מיקרוליטר של בופר עיכול פרוטאז K למכסה צינור ה-PCR.
טען את מכשיר האיסוף לתוך מחזיק הדגימה במיקרוסקופ. בחלון מכשיר איסוף השינויים. לך לכיוון נקודת ייחוס, כוון את פוקוס המצלמה כדי לראות בבירור את נקודת ההתייחסות והשתמש בבקרות החצים כדי למרכז אותה אם צריך.
טען חתך רקמה לתוך מחזיק הדגימה כשהרקמה פונה כלפי מטה ומיקום התווית מימין. בחר את עדשת האובייקטיב של 10 x וזהה אזורים בעלי עניין עם תכונות פתולוגיות ספציפיות. נווט לתפריט הלייזר.
לחץ על כיול, בחר כן והשלים כיול. בלוח הבקרה של הלייזר, כוון את עוצמת הלייזר ל-50, את הצמצם ל-5 ואת המהירות לתשע. לאחר מכן השתמש בסרגל הכלים הגרפי כדי לצייר עיגול סביב אזור היעד.
בחר צורה אחת, לחץ על התחלה לחתוך כדי ביצוע לכידת לייזר מיקרו-דיסקציה וממקם את מכשיר האיסוף לאיסוף הרקמה שנחתכה. כדי ללכוד תיעוד, תמונות, בחר קובץ ובחר לשמור תמונות לשמירת תמונות לפני ואחרי בפורמט המועדף. לאחר איסוף התאים הרצויים, לחץ על 'פריק' כדי להסיר את הקולקטור מהשלב.
ודאו ש-10 מיקרוליטר של בופר עיכול פרוטאז K נשארים במכסה וממלאים במידת הצורך. סגור את הצינור ועשה עליו מערבולת היטב. אחר כך סובב את הצינור לרגע בצנטריפוגה.
אחסן את הצינור בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד להוצאת ה-RNA. קטע הכבד המוצבע בהמטוקסילין על סלייד העט הוצג תחת מיקרוסקופ לפני ואחרי מיקרודיסקציה בלייזר. אזורים מעניינים המציגים סטיטוזיס מיקרו-וזיקולרי נאספו בדיוק לתוך הכיסוי של צינור PCR.
שמירה על מורפולוגיה תאית שלמה. סך החומצה הריבונוקלאית שהופקה מכ-1000 ו-2000 תאים מבודדים של מיקרודיסקציה בלייזר הניבה 110.7 ננוגרם ו-213.3 ננוגרם בהתאמה. כל הדגימות הראו טוהר גבוה עם יחס ספיגה של 260 על 280 ננומטר בין 1.9 ל-2.1.
אלקטרופורזה בג'ל חשפה רצועות ריבוזיות ריבוזיות מובחנות של 28 שניות ו-18 שניות. פרופילים ביואנליסטיים של חומצה ריבונוקלאית מ-1000 תאים בלבד. נתן מספר שלמות חומצה ריבונוקלאית של 6.7.
Q-R-T-P-C-R עבור גן הניקיון בטא אקטין הניב ערכי סף מחזור שנעים בין 17 ל-19. הערכת ביואנלייזרים של ספריות ריצוף שנבנו מ-50 ננוגרם של חומצה ריבונוקלאית כוללת הראתה שיא אופייני בין 300 ל-500 זוגות בסיסים. ריצוף RNA של ספריות אלו הניב נתונים באיכות גבוהה עם ציוני Q 20 ו-Q 30, מעל 90% ושיעור שגיאה נמוך בכל השכפולים.
שיקול חשוב הוא מניעת התפרקות באמצעות הפסקת בקרה, צביעה מהירה ותנאים ישרים בתהליך העיבוד. הזמנת הליך זה יכולה לשמש ל-PCR בזמן אמת ולרצף עם מפתחות ספרייה מותאמים לפרגמנטציה. מבוסס בדגימות כבד.
פרוטוקול זה מאפשר פרופילינג של תת-קבוצות הפטוציטים ותומך במחקר הפטולוגיה ממוקד בפתולוגיה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
This article presents a detailed protocol for laser capture microdissection (LCM) and RNA extraction from paraformaldehyde (PFA)-fixed, OCT-embedded mouse liver sections. The method enables the isolation of specific histological regions for downstream transcriptomic analyses, ensuring high RNA purity and integrity suitable for sensitive applications such as qPCR and RNA sequencing.
Key Study Components
Area of Science
- Hepatology
- Molecular Biology
- Histology
Background
- Chronic liver diseases often require spatially resolved molecular analysis of hepatocyte subpopulations.
- Traditional FFPE methods can compromise RNA integrity, limiting downstream applications.
- LCM allows precise isolation of defined cell populations from complex tissues.
- PFA fixation and OCT embedding preserve tissue morphology and RNA quality for transcriptomic studies.
Purpose of Study
- To establish a robust protocol for isolating specific liver cell populations using LCM from PFA-fixed, OCT-embedded tissue.
- To extract high-quality RNA suitable for transcriptomic analysis from microscale samples.
- To validate the protocol's effectiveness for downstream applications such as qPCR and RNA sequencing.
Methods Used
- Preparation of pen membrane slides with UV exposure and poly-L-lysine coating.
- Cryosectioning of PFA-fixed, OCT-embedded mouse liver at -20°C.
- Hematoxylin staining and RNase-free handling throughout the workflow.
- Laser capture microdissection of histologically defined regions (approx. 1,000 cells).
- RNA extraction, quantification, and quality assessment (A260/A280 ratio, RIN, gel electrophoresis).
- Downstream validation by qPCR for β-actin and RNA sequencing with fragmentation-optimized library preparation.
Main Results
- RNA yields from 1,000–2,000 cells ranged from 110.7 to 213.3 ng.
- RNA purity was high (A260/A280: 1.9–2.1).
- RNA integrity number (RIN) averaged 6.7 ± 0.9, consistent with PFA fixation.
- qPCR for β-actin showed Ct values of 17–19, indicating good RNA quality.
- RNA-seq libraries showed characteristic peaks (300–500 bp) and >90% of bases at Q20/Q30 quality thresholds.
Conclusions
- This protocol enables precise, spatially resolved gene expression analysis in liver tissue.
- RNA extracted is of sufficient purity and integrity for sensitive downstream applications.
- The method supports hepatocyte subgroup profiling and pathology-focused hepatology research.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Laser capture microdissection (LCM) of paraformaldehyde-fixed, OCT-embedded mouse liver tissue enables spatially resolved transcriptomic profiling of defined cell populations, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides high-purity RNA suitable for sensitive downstream analyses, facilitating confident target validation and disease-relevant pathway interrogation. The protocol addresses a critical inflection point for hepatology and pathology-focused R&D portfolios seeking robust, region-specific molecular insights.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables spatially precise interrogation of hepatocyte subgroups within complex liver tissue.
- Supports functional target validation by isolating histologically defined regions for RNA analysis.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking molecular signatures to specific pathological features.
- Improves predictive confidence for portfolio triage by providing high-quality, region-specific RNA data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological samples for downstream qPCR and RNA sequencing workflows.
- Ensures assay reproducibility through standardized tissue processing and RNA quality metrics.
- Delivers quantitative outputs (e.g., Ct values, RNA integrity) for reliable compound evaluation.
- Enables platform reuse for multiple transcriptomic applications in liver disease models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling with disease-relevant histopathology for translational biomarker discovery.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by supporting sensitive RNA-based analyses.
- Reduces biological risk in preclinical advancement decisions by ensuring sample integrity and data quality.
- Supports pathology-driven research in chronic liver disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This LCM protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling targeted gene expression analysis from fixed tissue sections, bridging histological assessment and molecular readouts.
- Discovery Biology: Provides spatially resolved hypothesis testing and pathway clarification in liver tissue.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative RNA outputs for assay development and validation.
- Analytics: Supplies high-purity RNA and robust quality metrics (A260/A280, RIN, Ct values) for comparative analyses.
- Translational Research: Connects histopathological features to transcriptomic profiles for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for spatial transcriptomics in fixed tissue models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and RNA extraction for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of liver disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryosectioning, histological staining, and LCM instrumentation.
- Demands access to RNase-free facilities and analytical infrastructure for RNA quality assessment.
- Necessitates cross-team standardization of tissue processing and RNA extraction protocols.
- May require adaptation for other tissue types or disease models with validation.
- RNA integrity is inherently limited by PFA fixation but remains suitable for qPCR and RNA-seq.
