פרוטוקול לאיסוף תלייה חד-תאית מקרנית עכברים
3 באפריל 2026
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשגת תליות חד-תאיות איכותיות מקרניות עכבר שלמות באמצעות עיכול רציף עם קולגנאז A וטריפסין. שיטה זו מניבה תאים בודדים ברי קיימא עם שלמות RNA גבוהה, מה שהופך אותם לתואמים ליישומים בהמשך כמו ריצוף RNA חד-תאי וציטומטרי זרימהy.
פרוטוקול זה מציג בעיקר שיטה להשגת תאים בודדים באיכות גבוהה מקרניות עכברים שלמות. השיטה שלנו היא תאים בודדים יעילים עם שלמות RNA גבוהה, מה שהופך אותם לתואמים ליישומים במעלה הזרם כמו תא יחיד על דק עבה ודייאמטריית זרימה. כדי להתחיל, הציב עכבר נקבה C57BL6 בת שישה עד שמונה שבועות שהושמתה על שולחן ניתוח סטרילי.
לאחר שטיפת העפעפיים הסגורים ב-PBS, השתמשו במספריים עיניים ליצירת חתך לאורך הקוטב האחורי של גלגל העין, ומניחים בזהירות את העין המבודדת בצלחת פטרי המכילה מדיום אפיתל הורמונלי קר וקר. לאחר שטיפת גלגל העין שלוש פעמים ב-1XPBS בתוספת 5% סטרפטומיצין פניצילין, השתמשו במספריים עיניים ומלקחיים כדי לבצע חתך מהקוטב האחורי לכיוון הלימבוס הקרנית. נתק בעדינות את הקרנית מהלבן והלחמית לאורך גבול הלימבל, ואז באמצעות שני זוגות מלקחיים, הסר לחלוטין את העדשה והקשתית.
לאחר שטיפת רקמת הקרנית שלוש פעמים ב-PBS, העבירו את הרקמה הנקייה לצינור חדש. הוסיפו מיליליטר אחד של חמישה מיליגרם לכל מיליליטר תמיסת קולגנאז A, וטחנו את הרקמה לחתיכות בגודל של כ-0.5 על 0.5 מילימטרים באמצעות מספריים עיניים. דגרו את הצינור המכיל את שברי הקרנית עם תמיסת קולגנאז A באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
בדקו את הרקמה כל 10 דקות במהלך העיכול. כאשר לא נותרו שברי רקמה גדולים, יש לצנטריפוגה את הדגימה ב-300G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ואז לשאוב בזהירות את הסופרנאנט. לאחר מכן, החזירו את הכדור לתמיסת 200 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין EDTA.
הניחו את הצינור באינקובטור תרבית תאים עם טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לעיכול שברי רקמה שנותרו. לבסוף, השתמשו בפיפטה P1000 עם קצה רחב כדי לשלב בעדינות את התערובת ולקבל תלייה חד-תאית. צנטריפוגה את תלות התא כפי שהודגם קודם, והשיה מחדש את כדור התא ב-PBS המכיל 0.04% BSA.
בספירת תאי הקרנית המבודדים באמצעות המוציטומטר, נמצא כי בסך הכל התקבלו 1.05 כפול 10 לכוח של חמישה תאים משמונה קרניות עם עמידות תאית ממוצעת של 94.6% ויחס תאים בודד העולה על 96.3%, מה שמאשר את התאמת התלייה ליישומים במורד הזרם. ניתוח אימונופלואורסצנציה הראה כי תאי ההשעיה התאים כללה 83.5% תאי אפיתל פאן-CK חיוביים, 13.5% תאי סטרומל חיוביים בקרטוקן, וכ-3% תאים שליליים לשני הסמנים. ה-RNA שהופק מהתלייה התא היחיד הציג מספר שלמות RNA גבוה של כ-8.8 ויחס RNA ריבוזומי של 28S על 18S של כ-2.15, מה שמאשר איכות RNA מצוינת.
לאחר קבלת תאים בודדים, ניתן לאפיין את תפקוד תאי הקרנית ואת חקר סימני פני השטח. בסמוך לכך חקר האינטראקציות בין תאים. אתגר בשיטה זו הוא למעשה להפריד את הקרנית מרקמות אחרות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול חסון לבידוד תרחיפי תאים בודדים באיכות גבוהה מקרניות של עכברים. השיטה משלבת דיסקציה מדויקת של הרקמה עם עיכול אנזימטי רציף, המאפשרת הכנת תאים בודדים חיוניים המתאימים ליישומים המשכיים כגון ריצוף RNA של תאים בודדים (scRNA-seq) וציטומטריה של זרימה. הפרוטוקול מניב מספר תאים גבוה, חיוניות מצוינת ושומר על שלמות ה-RNA, ובכך מקל על ניתוח מפורט של ההטרוגניות התאית בקרנית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- אופתלמולוגיה
- ביולוגיה של התא
- ניתוח של תא בודד
רקע
- הקרנית היא השכבה החיצונית ביותר של העין, והיא חיונית לראייה ולשמירה על ההומאוסטזיס של פני השטח של העין.
- ריצוף RNA של תא בודד (scRNA-seq) דורש תרחיפי תאים בודדים באיכות גבוהה.
- רקמת הקרנית היא צפופה ומורכבת, מה שהופך את דיסוציאציית התאים למאתגרת.
- פרוטוקולים קיימים גורמים לעיתים קרובות לחיוניות תאים נמוכה או לאיכות RNA ירודה.
מטרת המחקר
- ביסוס פרוטוקול מהימן להפקת תרחיפי תאים בודדים מקרניות עכבר שלמות.
- הבטחת חיוניות תאים גבוהה ושלמות של ה-RNA עבור יישומים המשכיים.
- מתן אפשרות לזיהוי וכמות מדויקים של סוגי תאי הקרנית העיקריים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הוצאת קרניות מעכברים מסוג C57BL6 שהורדמו.
- עיכול אנזימטי רציף באמצעות collagenase A ו-trypsin-EDTA.
- קיצוץ מכני וטריטורציה עדינה להשגת תרחיף של תאים בודדים.
- הערכת חיוניות תאים באמצעות צביעת trypan blue וספירה בהמוציטומטר.
- צביעה אימונופלואורסצנטית עבור Pancytokeratin (תאי אפיתל) ו-Keratocan (תאי הסטרומה).
- ניתוח שלמות ה-RNA באמצעות bioanalyzer.
תוצאות עיקריות
- הושגו כ-1.05 × 105 תאים משמונה קרניות.
- חיוניות תאים גבוהה (94.6%) ויחס תאים בודדים (96.3%).
- הרכב תאים: 83.5% תאי אפיתל חיוביים ל-pan-CK, 13.5% תאי סטרומה חיוביים ל-keratocan, וכ-3% שליליים לשני הסמנים.
- מספר שלמות RNA (RIN) של כ-8.8 ויחס 28S/18S rRNA של כ-2.15, המעידים על איכות RNA מצוינת.
מסקנות
- הפרוטוקול מייצר באופן מהימן תרחיפי תאים בודדים באיכות גבוהה מקרניות של עכברים.
- ההכנות התאיות מתאימות ליישומים תובעניים בהמשך, כולל scRNA-seq.
- שיטה זו מקלה על ביצוע מחקרים מפורטים של תפקוד תאי הקרנית ואינטראקציות בין תאים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
השגת תרחיפי תאים בודדים באיכות גבוהה מקרניות של עכברים חיונית לקידום מחקרים אופתלמולוגיים בשלבי הגילוי ולאפשר פרופיל תאי ברזולוציה גבוהה. פרוטוקול זה נותן מענה לצוואר בקבוק קריטי בהכנת תאים בודדים חיוניים עם RNA שלם מרקמה עינית דחוסה, דבר המשפיע ישירות על מהימנותן של אנליזות תאים בודדים בשלבים הבאים. הכנה תאית חסונה מגבירה את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות ותומכת ברציפות תרגומית בין שלבי הגילוי לקווי הייצור הפרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של ההטרוגניות התאית בקרנית ברזולוציה של תא בודד.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי שימור חיוניות התאים ושלם ה-RNA.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים באמצעות זיהוי מדויק של סוגי התאים.
- משפר את הביטחון החזוי לבחירת מטרות אופתלמולוגיות בשלבים מוקדמים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק תרחיפי תאים בודדים סטנדרטיים בעלי חיוניות גבוהה לצורך פיתוח בדיקות.
- מבטיח הדירות ותוצר כמותי עבור ריצוף RNA של תאים בודדים בשלבים הבאים.
- מכין חומר ביולוגי שעבר תיקוף עבור תהליכי סריקה ניתנים להרחבה.
- מאפשר הערכה מהימנה של השפעות תרכובות על אוכלוסיות נבדלות של תאי קרנית.
מחקר תרגומי ופקליני
- מתיישב עם מודלים הרלוונטיים למחלה על ידי שימור הגיוון הטבעי של תאי הקרנית.
- שומר על איכות ה-RNA לצורך גילוי ותיקוף של סמנים ביולוגיים תרגומיים.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי הבטחת רציפות נתונים משלבי הגילוי ועד לשלבים הפרה-קליניים.
- מפחית עמימות ביולוגית במחקרים אופתלמולוגיים פרה-קליניים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
פרוטוקול זה משלב בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר הפרה-קליני, ומאפשר מעבר חלק מדיסוציאציה של רקמה לניתוח של תאים בודדים ולמחקרים פונקציונליים המשכיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים ביולוגיים באמצעות אפשור פרופיל תא בודד ברמת דיוק גבוהה.
- סריקה: מספקת תרחיפי תאים בודדים כמותיים וניתנים לשחזור, המוכנים לביצוע בדיקות (assays) וסריקת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת מדדים חסונים של חיוניות תאים, כימות סוגי תאים ושלמות RNA לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: משמרת את הגיוון התאי ואת איכות ה-RNA לצורך התאמת סממנים ביולוגיים ותיקוף פרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: קובעת פרוטוקול סטנדרטי הניתן להתאמה בין תוכניות מחקר אופתלמולוגיות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מספק הכנות של תאים בודדים באופן סטנדרטי, הניתן לשחזור ובקנה מידה רחב.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקת הפרויקט (go/no-go) ומשפר את יעילות ההון במחקר ופיתוח בתחום האופתלמולוגיה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של נכסים בשלבי הגילוי.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטכניקות של דיסקציה של רקמה עינית ועיכול אנזימטי.
- נדרשת גישה למכשירים לבדיקות חיות תאים, אימונופלואורסצנציה וניתוח שלם של RNA.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין צוותים לצורך הדירות והשוואתיות של הנתונים.
- ניתן להתאימה לסוגי רקמות צפופות אחרות באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- דיוק בהפרדת הרקמה הוא קריטי כדי למנוע זיהום ולהבטיח את טוהר הדגימה.
