בדיקת היווצרות מושבה לזיהוי יכולת ההתרבות של תאי האוסטאוסרקומה שנגרמו ל-LncRNA

המחקר שלי מתמקד באוסטאוסרקומה ומטרתו לחקור כיצד הפילת LncRNA משפיעה על יכולת התרבות ארוכת טווח באמצעות בדיקות מידע על מושבות. כדי להתחיל, זרעו 5 פעמים 10 עד הכוח של 5 תאי אוסטאוסרקומה 143B לשני צלחות תרבית בגודל 10 סנטימטר. תרבית התאים ב-DMEM מלא בתוספת סרום בקר עוברי של 10% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו-חמצני של 5%.

הכינו את תגובות הטרנספקציה 24 שעות לאחר מכן, כולל פלסמידים, פוליאתילנימין וחומר חיוני אופטימיניום. סחרור כל מגיב ומאפשר לו להתאזן לטמפרטורת החדר לפני השימוש. עכשיו, תייגו ארבעה צינורות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר לפלסמידים ופוליאתילנימין באמצעות עט טוש.

פיפט 500 מיקרוליטר של OptiMinium Essential Medium לכל צינור. לאחר מכן מוסיפים 10 מיקרוגרם פלסמיד לצינור הפלסמיד המתאים ופיפטה של 30 מיקרוליטר פוליאתילנימין לכל צינור פוליאתילנימין. מערבבים כל צינור בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה ודגרו.

כעת משלבים כל צינור פלסמיד עם צינור הפוליאתילנימין המתאים לו. ערבבו בעדינות ודגרו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. שאפו בעדינות את מדיום התרבית מהכלים המכילים את תאי 143B.

הוסיפו שבעה מיליליטר של מדיום ללא סרום לכל מנה וסמנו את המנות לפי הפלסמיד שיש להוסיף. הוסיפו את תערובת הטרנספקציה המוכנה טיפה למנה המתאימה. הוסיפו את התערובת באיטיות בתנועה מעגלית מהקצה החיצוני לכיוון מרכז התערובת.

דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו-חמצני של 5%. להשליך את הסופרנטנט 8 עד 12 שעות לאחר מכן. לאחר מכן מוסיפים 10 מיליליטר DMEM מלא לצלחת התרבות ודגרו.

התבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה 72 שעות לאחר החלפת המדיום, הסרו את המדיום מכלי התרבית. הוסיפו 1.5 מיליליטר חומצה טריפסין-אדטה לעיכול התאים. תאים מפעילים פיפטה עדינה כדי לנתק את התאים.

לאחר מכן מוסיפים חמישה מיליליטר של מדיום מלא כדי לסיים את העיכול. העבר את מתלה התא לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 15 מיליליטר. לאחר מכן מפעילים פיפטה של 20 מיקרוליטר של תליית התא לתוך ההמוציטומטר כדי לספור את התאים.

אסוף 3 כפול 10 לכוח של 5 תאים לצורך הפקת חומצה ריבונוקלאית כדי לוודא את יעילות ההרס. כעת זרעו 2 פעמים 10 בעוצמה של 3 תאים בכל באר לתוך צלחת עם שישה בארות. פיפטה השלימה DMEM לנפח סופי של שני מיליליטר.

תרבית התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו-חמצני של 5%. לעקוב אחרי היווצרות מושבה מדי יום. סיימו את התרבית כאשר רוב המושבות בקבוצת הביקורת מכילות לפחות 50 תאים או לאחר 10 עד 14 ימי דגירה.

לאחר השלכת הסופרנאנט, שטפו את התאים פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS בכל באר, והשליכו את התמיסה לאחר כל שטיפה. תקבעו את התאים במיליליטר אחד של תמיסת פורמלין 10% למשך 15 דקות. להשליך את הקיבוס, ואז לשטוף את התאים פעמיים עם מיליליטר אחד לכל באר של PBS.

צבעו את התאים במיליליטר אחד של תמיסת סגול קריסטלית 0.5% למשך 10 עד 30 דקות. לאחר מכן שטפו בעדינות את הצלחת עם מים זורמים לאט. ייבשו את התאים באוויר בטמפרטורת החדר.

לצלם תמונות של המושבות באמצעות מצלמה. יעילות הטרנספקציה של תאי 143B אושרה על ידי מיקרוסקופיית פלואורסצנציה 72 שעות לאחר ההעברה, מה שמעיד על אספקת פלסמיד יעילה בשני התנאים. ניתוח תגובת RT-qPCR הראה כי ביטוי SNHG6 ירד באופן משמעותי בתאי 143B שהועברו ל-shSNHG6 בהשוואה לקבוצת shNC.

בדיקות היווצרות מושבות חשפו ירידה משמעותית במספר ובגודל המושבות בקבוצת הפלת SNHG6 בהשוואה לקבוצת הביקורת. פרוטוקול זה מעריך התרבות ארוכת טווח של תא יחיד, ומספק רלוונטיות ביולוגית גבוהה יותר ותוצאות חד-משמעיות יותר מאשר בדיקות רבייה מבוססות מטבוליה קצרות טווח. מחקרים עתידיים ירחיבו את הפרוטוקול הזה ל-LncRNA ומודלים נוספים של גידולים כדי לחקור באופן שיטתי מנגנונים המווסתים פוטנציאל התרבות של תאי סרטן.