טכניקה לייצוב חלבוני ממברנה בננו-דיסקים

פרוטוקול זה מדגיש תהליך שיחזור ננו-דיסקים שניתן לשחזר עם מסגרת שיטות שנוצרה. חומרי ניקוי מערערים את חלבוני הממברנה. ננו-דיסקים עם MSPs וליפידים תופסים מבנה טבעי לקריו-EM ולליזה.

התחילו בהוספת רכיבי הליפידים שהוכנו בכלורופורם למבחנה מזכוכית להכנת תערובת שומנים של 100 מיקרוליטר וערבבו היטב. אידוי את הכלורופורם תחת זרם עדין של גז חנקן עד שכל הנוזל יוסר. הוסיפו כ-2 מיליליטר של n-פנטאן בזרם טיפה למבחנה הזכוכית ואידוי את הממס באמצעות גז חנקן כדי לקבל שכבת ליפידים יבשה ושקופה.

לאחר ששחררו את מכסה הצינור, הניחו את הצינור במייבש הוואקום. פנו את המייבש ושמרו עליו בוואקום כדי להסיר ממסים שנותרו. לאחר מכן הסר את שכבת הליפידים ממייבש הוואקום והוסף 250 מיקרוליטר של בופר ללא חומרי ניקוי ודלי מלח כדי להרטיב את שכבת השומן, מה שמביא לריכוז סופי של 10 מיליגרם למיליליטר.

לאחר החזרת ההשפעה, חלקו אותו באופן שווה לארבעה צינורות זכוכית. סוניק את התלייה עד שהם הופכים לשקופים ושקופים, מה שמעיד על יצירת ליפוזום מוצלחת. לאחר מכן מיד שטוף את מרווח הראש של כל צינור בגז חנקן ואחסן בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד השימוש.

לאחר טרנספורמציה של תאי E.coli BL21 עם פלסמיד MSP1D1, הנושא תג 7-היסטידין והרחבת תרבית לאחר מכן. עורר ביטוי MSP על ידי הוספת IPTG לריכוז סופי של 0.5 עד מילימולר אחד. לאחר מכן המשיכו לגדל את התאים בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס במשך 16 עד 20 שעות עם ניעור.

צנטריפוגה את תרבית החיידקים בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. זרוק את הסופרנטנט ושמור על כדור התא. לאחר מכן החזירו את הכדור שמקורו בליטר אחד של תרבית ב-100 עד 150 מיליליטר של בופר ליזיס.

הומוגניזציה יסודית עד להשגת השעיה אחידה ללא גושים נראים לעין. לאחר מכן, השתמשו במכשול תאי אולטרסוני מקורר כדי לשבור את החיידקים בעוצמה של 35% עם מחזורים של פולסים של שלוש שניות, ואחריהם הפסקות של שש שניות. המשיכו לסוניק עד שהליזאט הופך לברור וצבעו חום בהיר.

צנטריפוגה את הליזאט ב-30,000 גרם למשך 45 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ואספו את הסופרנטנט לשלבים הבאים. לאחר דגירה של הסופרנטנט עם שרף ניקל-NTA מאוזן ושטיפה להסרת זיהומים, שחרור את החלבון היעד עם בופר ההליון ואיסוף חלקי האלואט. המשך לאסוף שברים עד שהספיגה של האלואט ב-280 ננומטר יורדת מתחת ל-0.01.

לאחר מכן העבר את האלואט המאוחד לצינורות דיאליזה, ודיאליזציה מול בופר הדיאליזה בארבע מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין ללילה. לאחר הדיאליזה, מרוכזים את התמיסה באמצעות מכשיר סינון אולטרה-סינון כדי לקבל ריכוז סופי של MSP של שניים עד חמישה מיליגרם למיליליטר. שקלו כ-250 מיליגרם של חרוזי ביולוגיה בתוך צינור צנטריפוגה בנפח 50 מיליליטר.

הוסיפו 25 עד 30 מיליליטר מתנול לצינור. סובב או מערבול היטב את התערובת בחושך. לאחר דגירה של הצינור בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, זרקו בזהירות את הסופרנטנט וחזרו על שטיפת המתנול פעמיים נוספות.

בצעו שטיפות דומות עם מים מזוקקים כפול שלוש פעמים, ואז הוסיפו 25 עד 30 מיליליטר של בופר ללא דטרגנט ועם מלח נמוך לחרוזים. נער או סובב את הצינור על שולחן מסתובב כדי לערבב ולדגור, כפי שהודגם קודם. השליכו את הסופרנטנט וחזרו על שלב האיזון של בופר במלח נמוך שלוש פעמים כדי לשלב את החרוזים במלואם.

חלק את חרוזי הביולוגיה המופעלים שווה בשווה לשלושה צינורות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר לשימוש נוסף. אסוף אליקו אחד של מלאי השומנים המוכן מראש והפשיר אותו. מיד, צנטריפוגה את הצינור ב-7,000 גרם למשך חמש שניות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס כדי לאסוף את התכולה בתחתית.

יש לבצע אולטרסוניקה של מלאי הליפידים באמבט מים בעוצמה של 60% ולעקוב אחרי הבהירות והטמפרטורה כל חמש עד עשר דקות כדי למנוע התחממות יתר. המשך בקול עד שמאגר הליפידים הופך לשקופ ונקי. חשב את הכמות המולרית של חלבון הממברנה היעד באמצעות המשוואה שהוצגה.

לאחר מכן מחשבים את הנפחים הנדרשים של תמיסות MSP ומלאי שומנים בהתבסס על יחס סטוכיומטרי מולרי של חלבון יעד ל-MSP לליפיד של אחד עד חמישה עד 250. משלבים את נפחי הליפיד וה-MSP המתאימים להכנת תערובת מאסטר של 300 מיקרוליטר ודגרו על קרח למשך 10 דקות. לאחר מכן מוסיפים בהדרגה 50 מיקרוליטר מהתערובת לתמיסת החלבון המרוכזת תוך כדי פיפטציה עדינה כדי להבטיח הומוגניות.

לאחר מכן מניחים את התערובת המשולבת על קרח לשעה, והפכו בעדינות את הצינור כל 15 דקות לערבוב יסודי. עכשיו, קחו אליקו אחד של חרוזי הביולוגיה המופעלים מראש ושאבו את הבופר המלח הנמוך שנותר לנו. הוסיפו את תמיסת החלבון לחרוזים ודגרו בסיבוב בחושך במשך שעה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

צנטריפוגה את התערובת ב-7,000 גרם למשך חמש שניות בארבע מעלות צלזיוס. העבר בזהירות את הסופרנטנט לאליקוט שני של חרוזי ביולוגיה שממנו נשאף הבופר דל המלח. לאחר ערבוב טוב של התוכן בהפיכה עדינה, דגרו בחושך במשך ארבע עד שמונה שעות או כל הלילה.

לאחר שהתמיסה החלבונית עוברת צנטריפוגה קצרה, העבר את הסופרנטנט לאליקו השלישי של חרוזים ביולוגיים מופעלים מראש. דגרו עם סיבוב בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס בחושך למשך שעה. לאחר צנטריפוגה קצרה, העבר את הסופרנטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי.

צנטריפוגה ב-17,000 גרם בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות להסרת הסכמים. לאחר טיהור קומפלקסי הננו-דיסק TASK2 באמצעות כרומטוגרפיה של החרגת גודל, איחד את חלקי השיא מהשחרור ומרוכזים אותם לריכוז סופי של ננו-דיסק TASK2 של 1.2 עד 1.5 מיליגרם למיליליטרים. כדי לאמת את מכלול הננו-דיסק, יש לנתח את הדגימות באמצעות 12% SDS-PAGE ולאשר את נוכחות MSP וחלבון ממברנה היעד.

פרופיל הכרומטוגרפיה של החרגת גודל הציג שני שיאים עיקריים התואמים לקומפלקס הננו-דיסק המורכב בנפח 15.1 מיליליטר ו-MSP חופשי בנפח 18.0 מיליליטר. כימות שטחי השיא הראה כי פסגת הננו-דיסק המורכבת הייתה בעלת שטח של 147.2. לעומת זאת, שיא ה-MSP החופשי היה בעל שטח של 31.5, התואם ליעילות הרכבה של 82.4% קומיגירציה של חלבון היעד, ו-MSP ב-SDS-PAGE אישר את שילובם לתוך קומפלקס ננו-דיסק יחיד.

פרוטוקול זה מסייע לחוקרים לחקור את מבנה חלבוני הממברנה באמצעות מבנה מערך הננו-דיסקים. החלק המאתגר ביותר הוא לייעל את היחס בין חלבון הממברנה, MSP והליפידים. ניתן לבצע גם בדיקות פונקציונליות, תהודה של פלזמון שטחי וספקטרומטריית מסה באמצעות הליך זה.