פיתוח ננוביסיקולות עטופות בממברנה של תאי גזע מזנכימיים לשיפור העברת הגנים

בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה להכנת ננו-וזיקולות שמקורן בתאי גזע מזנכימליים, הדומות לוזיקולות חוץ-תאיות ומקיפות AAVs לשיפור העברת הגנים. אנו קוראים לזה ננו-וזיקולות המכילות AAV CME-AAV. בהשוואה לווקטור הפצת גנים המתפתח EV-AAV, CME-AAVs מציעים גמישות רבה יותר במקורות התאים ותפוקה גבוהה יותר.

כדי להתחיל, יש להסיר את מדיום התרבית מכלי תרבית המכילה תאי גזע מזנכימיים אנושיים ב-70 עד 90% קולונציה. באמצעות מגרד תאים, נתק את התאים מהצלחת והעבר אותם לצינור חרוטי המכיל PBS. צנטריפוגה את התאים שנאספו ב-300 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס כדי להפיל את התאים.

לאחר מכן, שטוף את כדור התאים פעמיים עם PBS וצנטריפוגה שוב. החזירו את כדור התא הסופי ב-PBS בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז. לאחר מכן, להעמיד את תלת התא לשלושה מחזורי הקפאה-הפשרה כדי לשבש את ממברנת הפלזמה וליצור ליזאט גס.

באמצעות פיפטה, הומוגניזציה של הליזאט באופן יסודי. לאחר מכן, צנטריפוגה ב-1,000 גרם למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר פסולת תאית. העבר את הסופרנטנט לצינור חדש.

צנטריפוגה ב-18,000 גרם למשך שעה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס כדי לפרוק את שבר הממברנה. השליכו את הסופרנטנט והחזירו את כדור הממברנה ל-PBS כדי לקבל את החלק הגולמי של ממברנת תאי הגזע המזנכימליים. כעת, הומוגניזציה של תליית הממברנה על ידי העברתה ברצף דרך מזרקים המצוידים במחטים בקוטר 20 עד 27 גייג'.

קבעו את ריכוז החלבון של תסעיף הממברנה ההומוגני באמצעות בדיקת חומצה ביצינכונינית. עליקו את המתלים ואחסנו בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד שצריך. יש להיחליד מחדש את המתלים באמצעות מזרק 27 גייג' לאחר כל מחזור הפשרה.

מערבבים את תחום הממברנה המוכן עם וירוס אדנו-קשור, או AAVs, ביחס של 150 מיקרוגרם חלבון לאחד כפול 10 לכוח של 10 עותקי גנום. דגרו את התערובת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם ניעור עדין. טעין את הממברנה ותערובת הווירוסים לתוך מיני-אקסטרודר המצויד בממברנת פוליקרבונט בקוטר 400 ננומטר.

העבירו את התערובת דרך האקסטרודר 20 פעמים כדי לקדם את הכיסוי. החלפת ממברנת 400 ננומטר בממברנה של 200 ננומטר וחזרה על האקסטרוזיה. אסוף את תליית התהליך המכילה וירוס מכוסה, יחד עם וירוס לא מוקף וווסיקולות ריקות.

אסוף מספר אצוות, אם צריך, והמשך מיד לטיהור. מדלל את תמיסת היודיקסנול המקורית עם 10x PBS ומים סטריליים ללא יוניים כדי להכין תמיסות של 40% ו-25%. באמצעות פיפט, הוסיפו מיליליטר אחד של 40% יודיקסנול לתחתית צינור פתוח עם דפן דק ואולטרה-שקוף בנפח 13.2 מיליליטר.

לאחר מכן, הניחו שלושה מיליליטר של 25% יודיקסנול מעל שכבת ה-40% ליצירת גרדיאנט לא רציף. הנח בעדינות שבעה מיליליטר מהמתלה המעובד על ראש השיפוע. איזון הצינורות וטען אותם לרוטור דלי סווינג אולטרה-צנטריפוגה.

צנטריפוגה ב-150,000 גרם למשך שלוש שעות בארבע מעלות צלזיוס, תוך שימוש בהאצה מהירה והאטה איטית. לאחר מכן, הסר בזהירות את הצינורות מבלי להפריע למדרון. אסוף שברים של מיליליטר אחד מלמעלה למטה לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה מסומנים בנפח 1.5 מיליליטר.

תשמור על כל השברים בקפיא. כעת, יש לזהות ולאסוף את החלקים שבע ושמונה המכילים CME-AAV מטוהרים לתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה פתוח חדש. תשלים את הנפח ל-11 מיליליטר עם PBS.

לאחר מכן, מערבבים בעדינות עם פיפטה של מיליליטר. באמצעות האצה והאטה מהירות, צנטריפוגה את החלקים המצטברים בטמפרטורה של 150,000 גרם במשך שלוש שעות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. זרוק את הסופרנטנט בזהירות.

החזירו את הכדור ל-50 עד 200 מיקרוליטר של PBS סטרילי, בהתאם לריכוז הרצוי. Aliquot ההכנה המטוהרת. לאחר מכן, אחסן בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

הכינו פתרונות עובדים לוירוס מקופץ ושליטה בווירוס ב-PBS סטרילי. הוסף עותקים שוויים של הגנום של וירוס או נגיף בקרה ישירות למדיום התרבית בכל באר. כלול בארות בקרה שליליות עם נפח שווה ערך של PBS או חלקיקי וירוס ריקים.

סובב בעדינות את הפלטה כדי להבטיח פיזור אחיד ודגרה למשך 24 עד 72 שעות, בהתאם לעיצוב הניסוי. לאחר מכן, שאפו בעדינות את מדיום התרבות. שטוף את התאים פעמיים עם PBS מבלי להוציא אותם.

צבעו גרעיני צבע עם Hoechst 33342 לפי הוראות היצרן. לבצע הדמיה פלואורסצנטית של תאים חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך עם מערכות סינון מתאימות לחלבון פלואורסצנטי ירוק משופר ו-Hoechst. בחר מטרות של 10x או 20x לצורך כימות ו-63x אובייקטיביות להדמיה ברזולוציה גבוהה, אם צריך.

לרכוש לפחות חמישה שדות ראייה בכל באר, תוך שימוש בפרמטרי הדמיה זהים. שמור את כל התמונות בפורמטים גולמיים ואפורים לניתוח כמותי. מיקרוסקופ אלקטרוני מעבר גילה כי CME-AAVs הפגינו מידות גודל ומבנים קשורים לממברנה, בדומה לווסיקולות חוץ-תאיות.

סמני ממברנת תאי הגזע המזנכימליים, CD73 ו-CD90, זוהו ב-CME-AAV באמצעות ניתוח Western blot. שלושת חלבוני הקפסיד הווירוסיים העיקריים הקשורים לאדנו, VP1, VP2 ו-VP3, זוהו ב-CME-AAV על ידי SDS-PAGE. ניתוח NanoSight הראה כי CME-AAV9.

ל-EGFP היה קוטר ממוצע של 128.6 ננומטר וריכוז חלקיקים כולל של 1.32 כפול 10 בעוצמה של 10 חלקיקים למיליליטר. מיקרוסקופ פלואורסצנטי הראה כי CME-AAV9. EGFP יצר רמה גבוהה בהרבה של ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק בתאי HEK293T.

הווירוס עטוף בממברנה השיג ביטוי גנים גבוה בכ-2.5 פעמים, מה שמרמז על שיפור בקליטת התאים ואולי שיפור בתנועה תוך-תאית. הדמיית ביולומינסצנציה ב-vivo הראתה כי הכבד הפגין את האות הזוהר החזק ביותר לאחר מתן CME-AAV. ניתוח כמותי של אזורי כבד הראה כי מתן CME-AAV הוביל לרמות ביטוי גנים גבוהות משמעותית.

פרוטוקולים אלה מתארים שלבים להשגת AAVs עטופים בממברנת תא מטוהרת, או CME-AAV, באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה של אקסטרוזיה וגרדיאנט צפיפות. שני גורמים מרכזיים דורשים התייחסות זהירה: עיבוד מוקדם של קטעי תאים לצורך אקסטרוזיה ואופטימיזציה של יחס ערבוב מקטעי ממברנה ל-AAV לשליטה ביחס חלקיקים לגנום בין CME-AAV. מחקרים עתידיים יכולים להמשיך לחקור את מיכל ממברנת התא לשיפור ההגנה החיסונית ותכונות פני השטח התפקודיות, ולייעל את CME-AAV כפלטפורמה רב-שימושית להעברת AAV.