מיפוי מורפולוגיית תאי כוכב כבדיים במודלים של עכברים של פיברוזיס כבד

פרוטוקול זה מציג צינור הדמיה מקיף להמחשה ומידום מורפולוגיית תאי כוכב כבדיים ברקמת כבד שלמה. הדמיה דו-ממדית הנוכחית מפספסת את כל המורפולוגיה של התאים הכוכביים, מה שמגביל תובנות מבניות ותפקודיות. פרוטוקול זה מאפשר לכידות חזקות של ארכיטקטורת תלת-ממד מורכבת.

כדי להתחיל, צבוט את כפות ידיו של עכבר מורדם כדי להבטיח הרדמה נכונה. רסס את הבטן ב-70% אתנול כדי להרטיב את הפרווה. עם זוג מלקחיים, הרימו את העור במרכז הבטן המיושר עם הרגליים האחוריות והתחילו לחתוך את העור כדי לחשוף את הבטן.

לאחר מכן השתמש במקליות כותנה שהורטבו ב-PBS כדי להזיז מעיים ואיברים אחרים הצידה ולהרים את האונה השמאלית. חתכו בזהירות את הממברנה שמחוברת בין האונה השמאלית לאונה הזנה. לאחר מכן משתמשים בתפר לקשור בבסיס העליון של האונה השמאלית.

חתכו את האונה השמאלית מתחת לקשר התפר והניחו אותה בצד לאיסוף ועיבוד דגימות רקמה. השתמשו במקליות כותנה רטובות ב-PBS כדי להזיז את הכבד ולחשוף את וריד הפורטל. לאחר מכן מכניסים בזהירות את מחט הקטטר לווריד הפורטלי בערך באמצע אורכו.

הסר את מחט הקטטר. ודא זרימת דם חוזרת דרך הקטטר כדי להעיד על הכנסה מוצלחת. חבר את הצינור המלא ממשאבת הפרפוזיה הפועלת לקטטר וממלא את הכבד ב-20 מיליליטר של PBS.

מהדק את העורק הריאתי מעל הכבד עם המוסטט כדי למנוע מה-PBS לעבור דרך הלב. חתכו את הווריד הנבוב התחתון כדי לשחרר את הצטברות הלחץ. כוון את מהירות המשאבה לחמישה מיליליטר לדקה.

לאחר 15 דקות, עצרו את המשאבה כדי להחליף את המאגר ל-4% פאראפורמלדהיד, ואז ממלאים את הכבד ב-25 מיליליטר של 4% פאראפורמלדהיד. לאחר סיום הפרפוזיה, יש להסיר את הכבד מהאיברים הסובבים על ידי חיתוך הרקמות המקשרות. הנח את הכבד בצינור חרוטי בגודל 50 מיליליטר מלא ב-25 מיליליטר של 4% פרפורמלדהיד.

הנח את הצינור אופקית על פלטפורמת נדנוד ספסל למשך הלילה בחדר קר בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס במהירות של 1.5 סיבובים לדקה. ביום הבא, שוטפים את הכבד שלוש פעמים ב-PBS על פלטפורמת נדנוד למשך 30 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר בקצב של 1.5 סיבובים לדקה. העבר את הכבד ל-20 מיליליטר PBS עם 0.02% נתרן אזיד ואחסן בארבע מעלות צלזיוס.

חתוך את דגימות הכבד לחתיכות בגודל של כ-0.5 עד 1 סנטימטר מעוקב. העבר את דגימות הכבד לבקבוקי זכוכית עם מעליות ברגים. ייבשו את הדגימות בסדרת מתנול מדוללת במים בין 20% ל-80% על סיבוב גלגלים בקצב של שמונה סיבובים לדקה למשך שעה כל אחת בטמפרטורת החדר.

לאחר ביצוע הלבנת דגימה, פרמיאביליזציה, תיוג אימונולוגי וניקוי, דגרו את הדגימה בדיבנזיל אתר למשך לילה בטמפרטורת החדר לפני ההדמיה. ניתן לאחסן דגימות באתר דיבנזיל עד שנה ללא אובדן אות הצביעה. להדמיה קונפוקלית, הניחו את הדגימה שננקתה בתבנית זכוכית בקוטר 35 מ"מ עם תחתית זכוכית מספר 1.5.

מלאו את הקערת באתיל קינמט כדי לטבול את הדגימה לחלוטין. לאחר מכן מניחים את המנה על הבמה של המיקרוסקופ הקונפוקלי. רכוש תמונת אריחים במישור הבהיר ביותר כדי ללכוד שטח גדול מהדגימה באמצעות פורמט 1024 על 1024 ומהירות של 600.

בהתבסס על תמונת האריחים, בחר אזורים מעניינים כדי לאסוף סריקת Z ברזולוציה גבוהה יותר. לאחר מכן, רכוש ערימת Z המשתרעת על כל עומק הרקמה שננקתה ברזולוציה הגבוהה ביותר הנתמכת על ידי המיקרוסקופ בפורמט 1024 על 1024 ומהירות סריקה של 600. הפרפוזיה והקיבוע המוצלחים של כבד העכבר יצרו צבע צהוב בהיר ואחיד.

פרפוזיה לא נכונה גרמה לאזורים אדומים כהים או חומים של קרישי דם, שהפחיתו את הבהירות האופטית וגרמו לאות רקע גבוה באזורים אלו. שקיפות אופטית מלאה הושגה לאחר הדגירה באתר דיבנזיל, שם הרקמה נראתה צלולה לעומת לפני הניקוי. ערימות Z ברזולוציה גבוהה חשפו תהליכים דנדריטיים עדינים המתפשטים מגוף התא של תאים כוכביים בודדים בכבד.

גם דגימות כבד בקרת וגם דגימות כרוניות של פחמן טטרכלוריד הראו אותות פלואורסצנטיים חזקים ויציבים תחת מיקרוסקופיה קונפוקלית. צינור זה ממפה באופן שכפולי את מורפולוגיית התאים הסטלטיים בשרת המורכב של מיקרו-סביבה, ולוכד תהליכים דנדריטיים ויחסים מרחביים עם תאים שכנים. התחייבות בזמן היא שיקול חשוב בעת ביצוע הפרוטוקול.

תהליך הניקוי אורך כשלושה שבועות, ודורש תכנון מראש. באמצעות ניתוח מורפומטרי תלת-ממדי מדויק, פלטפורמה זו מקשרת את מבנה הפיברובלסטים לפונקציות, ומקדמת תובנות לגבי הומאוסטזיס רקמתי ומנגנון Z.