בידוד וטיהור איי הלבלב מחולדות לואיס באמצעות עיכול אנזימטי והפרדה בין צפיפות לגרדיאנט

המחקר שלנו מתמקד בפיתוח פרוטוקול בידוד עילי Lewis Rat סטנדרטי עם תפוקה גבוהה לאופטימיזציה של תפוקה, טוהר, כדאיות ואריכות ימים פונקציונלית. שיטות קיימות מניבות עיניים קצרות טומפות משתנות. פרוטוקול זה מאחד את העיכול, הטיהור והאיסוף לשיפור העקביות ואורך החיים.

כדי להתחיל, שים עכברוש שהושמד תחת מיקרוסקופ. באמצעות מספריים בעור, יש לבצע חתך בצורת V שמתחיל מהסינתזה הערווהית לכיוון כל כלוב צלעות צדדי כדי להגיע לחלל הבטן. באמצעות מלקחיים שטוחים, משכו את המעי הדק והגס לצד השמאלי של החיה כדי לפנות את חלל הבטן.

לאחר מכן השתמשו במלקחיים שטוחים ובהמסטטים מעוקלים כדי לפתוח את התריסריון העליון. ודאו שצינור המרה המשותף ווריד הפורטל הכבדי נמצאים בטווח הראייה. עכשיו השתמש בהמוסטאטים מעוקלים כדי למשוך את הכבד בכיוון הצפלון.

מהדק את צינור המרה המשותפת ואת הוריד הכבדי במרחק של מילימטר עד שניים מהכבד. במבט המיקרוסקופ, עם מלקחיים שטוחים והמוסטטים שטוחים, הניעו בעדינות את התוכן בתוך התריסריון כדי לנקות את הסוגר של ה-audi. לאחר מכן, מהדקים בעדינות את התריסריון, כחמישה מילימטרים מכל צד של הסוגר של האודי כדי לבודד את האזור הסובב.

יש להקפיד על דחיסה מינימלית לשמירה על שלמות הרקמה. הכנס בזהירות את מחט המזרק המכילה WDM סטרילי דרך דופן התריסריון הפנימי. העבירו את המחט דרך גוף הסוגר והעבירו אותה לתעלה הראשית של הלבלב לצורך פרפוזיה.

תוך שמירה על לחץ קבוע, יש להזריס 7 עד 10 מיליליטרים של WDM ללבלב בקצב של כ-500 מיקרוליטר לשנייה עד שהלבלב מתנפח לחלוטין. עכשיו, הסר את שני ההמוסטטים השטוחים מהתריסריון. לאחר מכן נתח בעדינות ושחרר את הלבלב מהמבנים הסובבים החל מהטחול, הקיבה, המעי הגס, התריסריריון והמזנטרי.

הרימו בעדינות את הלבלב המנוקב עם מלקחיים שטוחים והשתמשו במספריים דקים כדי לנתק כל חיבור רקמת חיבור שנותרה. מעבירים מיד את הלבלב שנלקח לצלחת פטרי עם תמיסת שטיפה קרה ולהתחיל לקצור את הלבלב הבא בזמן שהלבלב שנכרתו מנקה. לניקוי הלבלב השתמשו בזוג מלקחיים מעוקלים דקים ומספריים דקים לניתוח כדי להסיר בזהירות בלוטות לימפה, רקמת שומן, מסנטרי וכלי דם גדולים מהלבלב המנוקב אם קיימים.

העבר את הלבלב הנקי לבקבוק סטרילי בנפח 600 מיליליטר המכיל 25 מיליליטר של WDM קר. כסו את הבקבוקון בנייר אלומיניום סטרילי כדי לשמור על ניקיון בזמן ההעברה ממקום העבודה הניתוחי לחלל תרבית התאים. העבר את הכוסית לאמבט מים של שייקר אורביטלי במהירות של 130 סיבובים לדקה למשך 10 דקות.

בסימן חמש דקות, סובבו את הבקבוקון ידנית בכיוון השעון ואז נגד כיוון השעון כדי לסייע בניתוק הרקמות. ברגע ה-10 דקות, העבירו במהירות את הבקבוק וטבלו אותו בקרח כדי להאט את פעילות האנזים. לאחר מכן הוסיפו נפח שווה של בופר הקירור לתמיסה בכוס כדי לעצור את העיכול.

באמצעות מזרק בנפח 50 מיליליטר המצויד במחט עמוד שדרה 14 גייג', יש לשאוב ולהוציא בעדינות את תליית הרקמה שוב ושוב כדי להפריד שברי רקמה גדולים. העבר את המתלים לצינורות חרוטיים של 200 מיליליטר. לאחר הצנטריפוגה של המתלה, יש להוציא בזהירות את הסופרנטנט ולהחזיר את הפלט ל-100 מיליליטר של מדיום כביסה.

כעת סנן את המתלה דרך מסננת סטרילית של 500 מיקרומטר שמונחת מעל בקבוק סטרילית בנפח 600 מיליליטר כדי להסיר רקמה גדולה שלא נעכלה. העבר את הסינון לצינורות קוניים חדשים בנפח 200 מיליליטר לפני הצנטריפוגה שוב. לצורך טיהור עיניים, השתמש בפיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר מורכבת מראש כדי להחזיר כל פלט רקמה בתמיסת גרדיאנט של 15 מיליליטר לכל שני מיליליטר נפח כדור.

מערבבים בעדינות עד שהמתלים אחידים. יש לשחרר בזהירות 15 מיליליטר של תליית התא לתחתית כל צינור חרוטי של 50 מיליליטר תוך הימנעות ממגע עם דפנות הצינור כדי להבטיח שיפועים נקיים. לאחר מכן השתמשו במשאבת מזרק כדי להוציא 10 מיליליטר מכל שיפוע בקצב של חמישה מיליליטר לדקה, תוך הצבת קצה המחט בקוטר 16 כנגד הדופן הפנימית של הצינור כדי למנוע ערבוב.

לאחר צנטריפוגה של הצינורות, זהה את שכבת העין הממוקמת בממשקים בין שכבות הגרדיאנט. באמצעות פיפטת עבר מחוברת, אספו את שכבת העין, העבירו את העיניים שנאספו לצינור קוני מקורר מראש בנפח 200 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של מדיום כביסה. הגבר את הנפח ל-200 מיליליטר עם מדיום כביסה ובצע את שלבי השטיפה והצנטריפוגציה הבאים.

לאחר מכן, החלקים את העיניים באופן שווה לתוך צלחות פטרי של 100 מ"מ ללא תרבית רקמה, תוך שימוש בצלחת אחת לכל חמישה לבלב מעובדים. במהלך הבידוד הבדיקתי, התפוקה הייתה 3,330 שקולות עין לכל לבלב, עם קוטר עין חציוני במיכל 50 עד 100 מיקרומטר. הגודל האוטומטי הניב 98,832 אובייקטים בסך הכל, שהיו בקורלציה חזקה עם מקבילות ידניות לעפעפיים שנמדדו ביום האפס.

הטוהר האנדוקריני היה בערך 98.56% בהתבסס על צביעת דיתזון ביום הראשון. מדדי הגירוי היו 9.37 ביום הראשון, 8.34 ביום השלישי ו-6.7 ביום השביעי, ללא הבדלים משמעותיים בין נקודות הזמן. שיטה זו מאפשרת חקר השתלת עין, תפקוד תאי בטא, היפוך סוכרת, עטיפת עיניים ואינטראקציות עם מערכת החיסון או המיקרוסביבה עם העין.

פרוטוקול זה יכול להיות רלוונטי להשתלות טרום-קליניות, מודלים של סוכרת, מחקרי עטיפה ובדיקות תפקודיות חוץ-גופיות הדורשות עיני לואיס רט באיכות טוהר גבוהה.