שיטת HPLC-QQQ-MS יעילה ומהירה לכימות אלקלואידים טרופאן בצמחי מרפא

פיתחנו שיטת HPLC-QQQ-MS לכימות מהיר של שלושה אלקלואידים טרופניים עיקריים ב-Anisodus tanguticus. HPLC קונבנציונלי חסר רגישות לאלקלואידים טרופאניים. שיטה זו משתמשת בספקטרומטריית מסה רגישה מאוד כדי לפתור בעיה זו.

כדי להתחיל, שקלו במדויק 10.0 מיליגרם של תקני ייחוס היוסציאמין, אניזודמין הידרוברומיד וסקופולאמין הידרוברומיד. הכניסו אותם לבקבוקון נפחי נפרד בנפח 10 מיליליטר. הוסף מתנול בדרגת כרומטוגרפיה לקו המסומן בכל בקבוק נפחי.

המיס את התקנים היטב באמצעות טיפול אולטרסוני להכנת תמיסות סטנדרטיות בודדות בריכוז של 1.0 מיליגרם למיליליטר. לאחר מכן, העבר את התמיסות המקוריות לבקבוקי תגובת חום ואחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס בחושך. להכנת תמיסה ביניים סטנדרטית מעורבת של 10 מיקרוגרם למיליליטר, יש לפיפט 100 מיקרוליטר מכל תמיסה שהוכן מראש לתוך בקבוק נפחי בנפח 10 מיליליטר.

לאחר מכן, מוסיפים מתנול בדרגת כרומטוגרפיה לקו המסומן כדי לדלל את התמיסה. לאחר מכן, בצע ייבוש בהקפאה של חומר סופורה פלאבסנס טרי. לאחר מכן, באמצעות מטחנה מהירה, טחנו את החומר היבש לאבקה הומוגנית.

סנן את האבקה דרך מסננת בדיקה סטנדרטית בקוטר 0.25 מ"מ. שקלו בדיוק 20 מיליגרם של האבקה המסננת. העבר אותו לבקבוק נפחי בנפח 100 מיליליטר והוסף מתנול בדרגת כרומטוגרפיה ממש מתחת לקו המסומן.

לאחר מכן, בצע חילוץ אולטרסוני בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, הסר את הבקבוק הנפחי ומאפשר לו להתקרר ל-25 מעלות צלזיוס בטמפרטורת החדר. הוסיפו מתנול בדרגת כרומטוגרפיה לקו המסומן של 100 מיליליטר ולמערבב למשך שתי דקות.

לאחר מכן, הפיפטה מיליליטר אחד מהתמצית המוכנה לתוך בקבוק נפחי בנפח 100 מיליטר. הוסף מתנול לקו המסומן. נערו היטב כדי לערבב היטב וקבלו את התמיסה האם להזרקת HPLC.

לסינון דגימה, יש להכין מזרק חד-פעמי ללא מחטים בנפח מיליליטר אחד וממברנה מיקרופורית אורגנית בשלב אורגני בגודל 0.22 מיקרומטר. שאיבת 1.2 מיליליטר של תמיסת האם להזרקה למזרק וסינון התמיסה על ידי דחיפה איטית דרך הממברנה. אסוף את הסינון לתוך בקבוקון דגימה בנפח שני מיליליטר עם תוספת פנימית ואטום את הבקבוקון היטב עם מכסה.

הכן את שלב A הנייד על ידי מדידת 1000 מיליליטר של מים אולטרה-טהורים. הוסיפו 1.0 מיליליטר חומצה פורמית כרומטוגרפית וערבבו באופן אחיד באמצעות ערבוב מגנטי למשך 10 דקות. לאחר מכן, הכינו שלב B נייד באמצעות שימוש ישיר במתנול כרומטוגרפי ללא טיפול נוסף.

דגז נייד מפעיל פאזות A ו-B בתדר 40 קילוהרץ למשך 15 דקות באמצעות יחידות דה-גז אולטרסוניות נפרדות. חבר את הפאזות הניידות המנוקות בבקבוקי ממס נפרדים לקווי A ו-B המתאימים של מערכת HPLC. השתמש בעמודת C18 להפרדה כרומטוגרפית.

איזון העמודה עם מתנול ומים ביחס של 80 ל-20 למשך 30 דקות בקצב זרימה של 0.3 מיליליטר לדקה. כוונו את טמפרטורת תנור העמודה ל-30 מעלות צלזיוס וחממו מראש 10 דקות מראש. לאחר מכן, קבעו את קצב הזרימה ל-0.60 מיליליטר לדקה, את נפח ההזרקה לשני מיקרוליטרים, ואת אורך גל הגילוי ל-210 ננומטר.

לאחר מכן, הגדר את תוכנית ההעברה הגרדיאנטית עם התנאים המוצגים. לבצע זיהוי ספקטרומטרי מסה באמצעות ספקטרומטר מסה משולש קוודרופולי המצויד במקור יינון אלקטרוספריי הפועל במצב יוניזציה חיובית. כוון את לחץ הנבולייזר ל-15 פאונד לאינץ' רבוע, מתח קפילרי ל-4,000 וולט, טמפרטורת גז ל-300 מעלות צלזיוס, וזרימת גז ל-11 ליטר לדקה.

לאחר מכן, הגדר את הפרמטרים לזוגות יוני ניטור תגובות מרובים. כדי לזהות יוני קדם-קודמים, יש להחדיר ישירות פתרונות סטנדרטיים בודדים במצב סריקה MS2. לאחר אימות השיטה, יש לבצע איסוף נתונים במצב ניטור תגובה מרובה.

השתמשו בפרמטרים האופטימליים, כולל יון מקדים, מעברי יוני מכפלה, מתח פרקטור ואנרגיית התנגשות לכל אנליט כפי שמוצג כאן. השיק את תוכנת הניתוח האיכותני. בחר קובץ ובחר לייבא נתונים כדי לייבא את כל קבצי הנתונים שנאספו.

בדוק את סימטריית השיא ועקביות זמן השימור של שיאי היעד בכל כרומטוגרמה יונים שנחצפה. במודול הכמות, בחר במעבר MRM. הזן את זוגות יוני המקדים ויוני המכפלה עבור כל רכיב וחלץ את כרומטוגרמות היונים המופקות המתאימות.

חשב את שטח השיא לניתוח כמותי. כל שלושת האלקלואידים הטרופאניים המטרה הופרדו בהצלחה בתוך 20 דקות בתנאי HPLC האופטימליים. הרזולוציה בין סקופולמין לאניזודמין הייתה 8.67.

בעוד שהרזולוציה בין אניזודמין להיוציאמין הגיעה ל-11.58, כל ערכי הרזולוציה עלו משמעותית על קריטריון ההפרדה הבסיסית של 1.5. כל האנליטים הראו ליניאריות טובה בטווח ריכוז של 0.014 עד 0.320 מיקרוגרם למיליליטר עם מקדמי קורלציה גבוהים מ-0.99. ההחלמה הממוצעת הייתה 101.44% לסקופולאמין, 100.25% לאניזודמין, ו-99.56% להיוסציאמין, עם סטיות תקן יחסיות של 1.85%2.35% ו-1.9% בהתאמה.

כימות של שלושה אלקלואידים טרופאנים ב-10 דגימות Anisodus tanguticus הראה כי תכולת הסקופולמין נעה בין 0.3667 מיליגרם לגרם בדגימה שש ל-1.0356 מיליגרם לגרם בדגימה שבע. תכולת האניסודמין נעה בין 0.0269 מיליגרם לגרם בדגימה 6 ל-0.3590 מיליגרם לגרם בדגימה 10. תכולת היוסיאמין נעה בין 0.2930 מיליגרם לגרם בדגימה השנייה ל-1.4989 מיליגרם לגרם בדגימה 10, כאשר רמות גבוהות יותר נצפו בדגימות ארבע, שבע, תשע ועשר.

פרוטוקול זה מאפשר כימות מהיר ומדויק של שלושה אלקלואידים טרופאניים עיקריים. האתגר המרכזי הוא להבטיח את תהליך המכשירים והכנת הדגימה הסטנדרטית למדידה מדויקת. שיטה זו יכולה להיות מורחבת לחקור ולכמת מטבוליטים אחרים ב-Anisodus tanguticus.