תכנות מחדש של קווי תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מדגימות מעילי באפי קפוא

מטרת הפרוטוקול הזה היא לתכנת מחדש פרווה קפואה של בני אדם או PBMCs לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים. פרוטוקול זה מטהר באופן ייחודי את שכבות הבאפי לאחר ההפשרה ומזהה מורפולוגיה של תאים סומטיים המצביעה על הצלחה בתכנות מחדש. כדי להתחיל, להוציא את המעיל הקפוא של הבאפי שמקורו בדם אדם ולהניח אותו על קרח.

סובבו בעדינות את הדגימה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס והסירו את הבקבוקון כאשר נשאר רק גביש קרח קטן. העבר בזהירות את תכולת הבקבוקון בדרופווייז לצינור חרוטי המכיל 12 מיליליטר DPBS. שטוף את הבקבוקון במיליליטר אחד של DPBS, והוסף את השטיפה לצינור הקוני המכיל את התאים שנלקחו.

צנטריפוגה את הדגימה באמצעות רוטור דלי מתנדנד ב-200 גרם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. הסר בזהירות את הסופרנטנט, והחזיר את כדור התא בארבעה מיליליטר DPBS המכיל 1% FBS. לאחר מכן, שכבות עדינות של תערובת ה-Buffy Coat על פני שלושה מיליליטר של תמיסת גרדיאנט צפיפות, תוך הימנעות מערבוב בממשק.

צנטריפוגה משתמשת ברוטור דלי מתנדנד ב-800 גרם למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר עם הבלם כבוי. באמצעות פיפטה, יש להסיר ולזרוק את שכבת הפלזמה העליונה מבלי להפריע לממשק הפלזמה לגרדיאנט. לאחר מכן הסר את שכבת תא הדם המונו-גרעיני ההיקפי, או PBMC, בממשק והעבר אותו לצינור נקי בנפח 15 מיליליטר.

שטפו את ה-PBMC על ידי הוספת שלושה מיליליטר של מדיום התפשטות וצנטריפוגה ב-200 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הסר בזהירות את הסופרנטנט והחזיר את הכדור לשני מיליליטר של מדיום התפשטות המכיל ציטוקינים כמו SCF, IL-3, EPO ו-IGF-1. לוחן את התאים בבאר אחת מתוך צלחת של 12 בארות.

תרבית התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני ו-20% חמצן למשך 10 עד 14 ימים. החלף חצי מהמדיום כל יומיים עד שנצפית אוכלוסייה צפופה של אריתרובלסטים בהירים ועגולים, מה שמעיד שהתאים מוכנים להעברה. שלושה ימים לאחר ההעברה עם וירוס סנדאי הנושא את גורמי יאמאנקה, יש לשים את התאים על פיברובלסטים עובריים בעכבר בקצב של שני מיליליטר לבאר.

דגרו את התרביות במשך כ-7 ימים, והאכיל מושבות מתפתחות במדיה hESC כל יומיים. הניחו את הפלטה המכילה את התאים המומרים והמושבות שנוצרו תחת מיקרוסקופ ניתוח. השתמשו במיקרוסקופ כדי לאתר מושבה אחת, לפתוח ולהרים את מכסה הפלטה כדי לחשוף את הבאר.

פתח את המזרק באופן אספטי וחשוף את המחט. בהנחיית המיקרוסקופ, השתמש בקצה המחט כדי לנתק את המושבה מתאי ההזנה הסובבים על ידי מעקב אחר קווי המתאר של המושבה. השתמש בקצה המחט כדי לחתוך את המושבה לכמה חתיכות בגודל שווה.

אם החלקים לא נפרדו, השתמש בצד המחט כדי לגרד או לגרד אותם מהצלחת עד שהם צפים. כעת באמצעות פיפטת P200, מאתר את המושבה שנקטפה תחת המיקרוסקופ, שאפו את המושבה הצפה עם הפיפטה, והעבירו לבאר של צלחת 24 בארות מוכנה. ודא שכל המושבה מועברת מבלי לאסוף מושבות או תאי הזנה אחרים.

הנח את הפלטה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני ו-20% חמצן עד להשגת המפגש הרצוי. זהה מושבות גדולות, עגולות ומציגות קצוות זוהרים כמוכנות להתפצלות. שאבו את המדיה מהבאר ושוטפים את הדגימה פעם אחת עם מיליליטר אחד של DPBS.

לאחר מכן הסר את ה-DPBS והוסיף 500 מיקרוליטר של בופר דיסוציאציה EDTA של 0.5 מילימולר. דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני למשך שתי דקות עד שהמושבות משתחררות והתאים מתעגלים. לאחר מכן, הסר את הלוח מהאינקובטור ושאוף את בופר הדיסוציאציה של EDTA.

באמצעות פיפטת P1000, אספו את התאים עם מיליליטר אחד של מדיום תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה עד שהמושבות מתנתקות ומתפרקות מעט. העבר את המיליליטר האחד של מדיום ותאים ללוח חדש עם שישה בארות המכיל מיליליטר אחד של מדיום תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים טריים. הנח את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני ו-20% חמצן.

האכיל תאי גזע פלוריפוטנטיים מונעים מדי יום עד שהבאר מתכנסת ומוכנה להתפצלות. בינתיים, ציפו צלחת בגודל 10 סנטימטר ב-7 מיליליטר של 5 מיקרוגרם לתמיסת ויטרונקטין שהוכנה ב-DPBS ודגרו אותה בטמפרטורת החדר למשך שעה. כדי להמשיך לפיצול, הוסף 7 עד 10 מיליליטר של מדיום תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושי לצלחת באורך 10 סנטימטרים והעבר תאים מהצלחת בעלת שש הבארות לצלחת ביחס של 1:1, ודגר כפי שהודגם קודם.

וודא שהתאים בצלחת של 10 סנטימטר מתכנסים לפני שתפצל את התאים שוב. כוון את יחס הפיצול לפי מורפולוגיית תא וצפיפות, בדרך כלל באמצעות יחס 1:10, ורשום את מספר הקטע בכל מעבר. לבסוף, אפיין תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים על ידי אישור ביטוי NANOG של סמן גזע באמצעות אימונופלואורסצנציה.

המיין את התאים לקווי אקטודרם, מזודרם ואנדודרם באמצעות תנאי תרבית מוגדרים. הערכת פוטנציאל התבדלות על ידי צביעה עבור PAX6, Brachyury ו-SOX17, יחד עם אובדן ביטוי NANOG. בסוף ההתרחבות, PBMCs התמיינו לאריתרובלסטים שהופיעו כתאים עגולים ובהירים בגודל גדול וקטן.

לעומת זאת, תרביות ללא תאים אלו או שנראו מתות לא היו סבירות להצליח לתכנת מחדש. ההצלחה בהעברה ותכנות מחדש התאפיינו בהופעת מושבות תאי גזע פלוריפוטנטיות מושרות על תאי הזנה מוקרנים, שפיתחו לאחר מכן מורפולוגיה טיפוסית של תאי גזע. לעומת זאת, תאים שלא אימצו מורפולוגיה דמוית תאי גזע לא תכנתו מחדש בהצלחה.

תאי גזע פלוריפוטנטיים מתוכנתים בהצלחה הציגו מושבות צפופות ועגולות עם קצוות חלקים ובהירים. תת-שיבוטים עם מורפולוגיה פחות אידיאלית, כמו דיפרנציאציה ספונטנית או מרכזים צפופים, נוקו על ידי התאמת תנאי הפיצול. חלק מהמושבות שנבחרו לא הצליחו להתרחב.

בנוסף למורפולוגיה, תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים הראו גזע, כפי שניתן לראות בביטוי סמן הגזע NANOG. תאי גזע פלוריפוטנטיים מתוכנתים מחדש הראו פוטנציאל התמיינות לאקטודרם, מזודרם ואנדודרם. פרוטוקול זה מספק נקודות ביקורת מפורטות למעקב וחיזוי הצלחת התכנות מחדש.

כדי לאשר עוד יותר שקו iPSC מתאים לשימוש, יש לבצע קריוטיפינג, גנוטיפינג ובדיקות מיקופלזמה באופן קבוע. פרוטוקול זה מאפשר תכנות מחדש מאוכלוסיות מטופלים קיימות עם מעילים באפי ביובנקיים, מה שמרחיב את התועלת של טכנולוגיית iPSC.