חילוץ DNA בעמודה בקצב בינוני באמצעות מדפי 24 בארות
24 ביולי 2026
פרוטוקול זה מתאר שיטה חסכונית להאצת חילוץ DNA מפלסמיד. באמצעות מדפי תלת-ממד מותאמים אישית התואמים לרוטורים סטנדרטיים עם פלטות דלי מתנדנדות, חוקרים יכולים לעבד עד 48 עמודי סיבוב עם פקקים או עד 116 עמודות סיבוב ללא פקקים בו-זמנית, מה שמקצר משמעותית את זמן הטיפול בהשוואה לשיטות מיקרוצנטריפוגה ידניות.
המחקר שלנו מתמקד במסילות המודפסות בתלת-ממד להפקה מקבילה של DNA ו-RNA באמצעות עמודי ספין (spin-column), המגשרות בין שיטות ידניות לאוטומטיות. מאמר זה נותן מענה למגבלות של שיטות ידניות עמודי ספין הדורשות עבודה מאומצת, על ידי מתן אפשרות לעיבוד סימולטני של עד 116 דגימות DNA או RNA. כדי להתחיל, השתמשו במדפסת תלת-ממד מסוג Fused Filament עם נחיר של 0.4 מילימטר כדי להדפיס את המעמד.
השתמשו בפילימנט גנרי מסוג פולילקטיד (PLA), פוליאתילן טרפתלאט גליקול (PETG) או אקרילוניטריל בוטאדיאןה סטירן (ABS) עם מילוי (infill) של 100%. הגדירו את גובה השכבה ל-0.1 millimeter והפעילו החלקה של פני השטח. התאימו את הגדרות ההדפסה כדי להבטיח אטימות למים ויציבות מכנית.
יש לבחון את עמידותם של הסטנדים לאטימות מים לפני השימוש הראשוני. מלאו את המאגר המודפס ב-70% ethanol כדי לבחון אותו לפני השימוש. בצעו סנטריפוגה למשכים הולכים וגדלים כדי לוודא שאין דליפות או נזק מבני.
לאחר בדיקה מוצלחת באמצעות דבק, חברו את רכיבי מיכל הבסיס יחד ליצירת יחידה אטומה. חדירו Escherichia coli, או טרנספורמנטים של E.coli, לתוך 3 עד 5 מיליליטר של lysogeny broth, או מצע LB, המכיל אנטיביוטיקה מתאימה. דגרו את התרבית למשך 12 עד 16 שעות ב-37 °C עם ניעור.
סבב במערך צנטריפוגה ב-2000 G למשך 10 דקות כדי לאסוף את התאים. השלך את העלייה (supernatant). הוסף 250 microliters של חוצץ השעיה (re-suspension buffer) למשקע.
יש להחזיר את המשקע לתמיסול מלא באמצעות וורטקס או פיפטינג. הוסף 250 microliters של lysis buffer. ערבב בעדינות על ידי הפיכת המבחנה ארבע עד שש פעמים או על ידי ניעור של פלטת 24 הבארים.
הוסיפו 350 µL של בופר נטרול וערבבו. צפו בהיווצרות של משקוע לבן כדי לאשר שהנטרול הצליח. הוסיפו בופר ליזיס לשפרובית המכילה אבקת titanium dioxide.
הוסף יחס של שניים לאחד בין נפח למסה. הוסף 250 µL של תגלי הטיטניום דיאוקסיד לליזאט. ערבב על ידי ניעור המבחנה.
הוסף 350 µL של תמיפת ניטרול וערבב היטב. סבב בצנטריפוגה ב-2000 G למשך 10 דקות. ניתן להבחין במשקע התאים ששקע לחלוטין בנוכחות טיטניום דו-חמצני, בעוד שהנוזל העליון נראה שקוף לחלוטין.
בהיעדרו של טיטניום דיאוקסיד, שימו לב לנוכחות של משקע שיורי בנוזל העליון. אספו את הנוזל העליון מבלי להפריע למשקע והעבירו אותו לעמודת הקשירה. הניחו את עמודות קשירת ה-DNA בשכבת מחזיקי העמודות של הראק.
מקמו את מכסי העמודות בחריצים הייעודיים כדי לאבטח אותם במהלך הצנטריפוגציה. הניחו את עמודי ההבהרה או הסינון בשכבת עמודי הסינון ישירות מעל עמודי הקשירה. העבירו את הליסאט המנוטרל שהוכן אל עמודי הסינון.
הניחו את העמד המורכב בתוך רוטור עם דלייים נדנדים. סבבו בצנטריפוגה ב-2000 G למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר הוצאת העמד מהצנטריפוגה, הסירו והשליכו את שכבת עמודת הסינון.
שפכו את הנוזל שעבר מהמאגר למכל פסולת. הרכיבו מחדש את המערך עם עמודי הקשירה. הוסיפו 500 עד 700 µL של בופר שטיפה לכל עמוד קשירה.
סבבו בצנטריפוגה ב-2000 G למשך דקה אחת. השליכו את הנוזל שעבר מהמאגר וחזרו על שלב השטיפה כפי שהודגם קודם לכן. הוציאו את עמודי הקשירה (binding columns) מהמעמד והעבירו אותם למבחנות איסוף של שני מיליליטר.
סבבו בצנטריפוגה ב-10,000 G או יותר למשך דקה אחת כדי לייבש את הממברנה. העבירו את העמודות למבחנות נקיות בנפח 1.5 מיליליטר. הוסיפו 50 µL של באפר אלוציה או מים ישירות לממברנה והדגרו את העמודות למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.
סובב במרכזית (צנטריפוגה) ב-10,000 G או יותר למשך דקה אחת כדי לשחרר את ה-DNA. תנובת הפלסמיד הכוללת לא הראתה הבדל משמעותי בין השיטה הקונבנציונלית לבין השליפה באמצעות תצורות המדפים. אישור הפלסמיד נשמר עם התפלגויות דומות של צורות רפויות, ליניאריות וסליליות-מישורית (super coiled).
הפיזור של הצבע היה מוגבל לאזור הפסולת שנמצא ישירות מתחת לעמודים הטעונים, ללא אות גלויה שהזוהתה בבארים סמוכות או בקצות עמודים שכנים, מה שמעיד על כך שעיצוב הסטנד (rack) מפחית את הסבירות להשפרצות ולהעברה בין העמודים. הגברה זוהתה רק בתסננים מעמודים אליהם הוסף האמפליקון. חלקיק זה מאפשר לחוקרים להשיג plasmid DNA באיכות גבוהה עבור יישומים המשכיים, כולל שיクלו닝, רצף וניתוח PCR.
השיקול החשוב ביותר בעת ביצוע פרוטוקול זה הוא מניעת זיהום צולב באמצעות שמירה על מאגר מודפס בתלת-ממד, אטום למים שאינו גולש. בנוסף, לאחר ביצוע הליך זה, ניתן להשתמש במעמדים אלו לכל ניתוח של מיצוי חומצות גרעין מבוסס עמודות.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה חצי-אוטומטית וניתנת להרחבה להפקת DNA בתפוקה גבוהה באמצעות עמודי ספין עם ממברנת סיליקה. על ידי שימוש במעמדים בהדפסת תלת-ממד בהתאמה אישית, התואמים לרוטורים של לוחות צנטריפוגה סטנדרטיים, גישה זו מאפשרת עיבוד מקבילי יעיל של סדרות דגימות גדולות, ומספקת חלופה חסכונית למערכות יקרות לאוטומציה של טיפול בנוזלים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה מולקולרית
- גנומיקה
- אוטומציה של מעבדה
רקע
- מיצוי באמצעות עמודי ספין עם ממברנת סיליקה נמצא בשימוש נרחב לטיהור DNA באיכות גבוהה.
- עיבוד ידני הוא עתיר עבודה וקשה להרחבה עבור מספרים גדולים של דגימות.
- רובוטים אוטומטיים לטיפול בנוזלים הם לרוב יקרים באופן בלתי סביר עבור מעבדות קטנות.
- קיים צורך בפתרונות נגישים ומדידים עבור מיצוי DNA.
מטרת המחקר
- פיתוח זרימת עבודה יעילה וחלקית-אוטומטית להפקת DNA.
- תכנון מתאמי הדפסה בתלת-ממד המאפשרים עיבוד בסביבת תפוקה גבוהה באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי.
- גישור על הפער בין מיני-פרפרים (minipreps) ידניים לבין אוטומציה יקרה.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- מתקנים בהדפסת תלת-ממד בעיצוב מותאם עבור עמודי ספין.
- עיבוד מקבילי של עד 116 עמודי ספין מסחריים.
- תצורה מקננת להבהרה סימולטנית של הליזט וקישור DNA בשלב צנטריפוגה אחד.
- מאגר פסולת משותף לפישוט שלבי השטיפה וניהול הפסולת.
תוצאות עיקריות
- תנובת ה-DNA וטוהרן דומים לפרוטוקולים ידניים סטנדרטיים.
- זמן העיבוד הכולל פוחת ב-50–70% עבור סדרות הגדולות מ-24 דגימות.
- זמן העיבוד עבור סינון, שטיפות ופינוי פסולת פוחת ב-5–10 דקות ללא קשר לגודל הסדרה.
- המערכת היא בקוד פתוח וכלכלית עבור מעבדות קטנות ובינוניות.
מסקנות
- המערכת החצי-אוטומטית מגדילה משמעותית את התפוקה והיעילות של מיצוי ה-DNA.
- היא מציעה חלופה מעשית ומשתלמת לאוטומציה מלאה עבור מעבדות רבות.
- גישה זו הופכת את הגישה לטכנולוגיית טיהור DNA בתפוקה גבוהה לנגישה יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הפקה יעילה וניתנת להרחבה של DNA מהווה צוואר בקבוק קריטי בתהליכי סריקה וגילוי תרופות מונחים גנומיקה. מערכת זו, שהיא חצי-אוטומטית ובעלת תפוקה בינונית, מאפשרת טהרה איכותית של חומצות גרעין בחלק קטן מהעלויות וממאמץ העבודה של אוטומציה מלאה, ובכך היא מספקת תמיכה ישירה לצוותי מו"פ בביופארמה השואפים להגדיל את תפוקת הדגימות ללא השקעה הונית משמעותית. גישה זו מגשרת על הפער שבין מיני-prep ידני לבין רובוטיקה יקרה, ובכך היא משפרת את הגמישות התפעולית ואת הקצאת המשאבים לאורך צינורות הגילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר מיצוי DNA מהיר ומקבילי לתמיכה בבדיקות סריקה גנטית ובמחקרים לזיהוי מטרות.
- מקל על עיבוד דגימות בספיקת גבוהה לצורך בחינת מסלולים ומחקרים מכניסטיים.
- משפר את עקביות הדגימות ומפחית את השונות בבדיקות מולקולריות המשך.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין DNA באיכות גבוהה עבור פיתוח בדיקות, גנוטיפיקציה ופלטפורמות לסריקה מולקולרית.
- תומך בסטנדרטיזציה ובשחזוריות על ידי מזעור שלבי הטיפול הידני.
- מבצע התרחבות יעילה עבור עיבוד של סדרות (batch processing), המאפשרת סריקה חסונה של ספריות גנטיות או תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מספקת הפקה אמינה של DNA עבור מחקרים לגילוי ותיקוף של סמנים ביולוגיים.
- שומר על שלמות הדגימה עבור מחקר תרגומי הדורש איכות עקבית של חומצות גרעיניות.
- מאפשר רציפות משלב הגילוי המוקדם ועד לאישוש פרה-קליני באמצעות תמיכה במערכי דגימות גדולים יותר.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
מערכת המיצוי החצי-אוטומטית הזו משתלבת בין שלבי הגילוי המוקדמים לבין זרימות עבודה פרה-קליניות, ומאפשרת מעבר חלק ממחקרים מונחי-השערה לסריקה בthroughput גבוה ולמחקר תרגומי.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות ובניתוח מסלולים על ידי אפשור הפקת DNA יעילה ממערכי דגימות מגוונים.
- סריקה: מספק תנובת DNA כמותית וניתנת לשחזור, המתאימה לבדיקות מולקולריות המשך ולפלטפורמות סריקה.
- אנליזה: מספק קלט עקבי של חומצות גרעין לצורך ניתוחים השוואתיים והערכה סטטיסטית של תנאי ניסוי.
- מחקר תרגומי: עולה בקנה אחד עם מחקרי סממנים ביולוגיים ומחקרים פרה-קליניים הדורשים הכנת DNA איכותית וניתנת להרחבה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה ניתנת להתאמה ובקוד פתוח לשימוש חוזר בתוכניות מו"פ מרובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתוצאות החזיות על ידי הבטחת איכות ה-DNA ועקביות בין ניסויים.
- ערך תפעולי: מפחית את העבודה הידנית ואת זמן העיבוד ב-50–70% עבור סדרות גדולות, ובכך משפר את יעילות המעבדה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר הרחבה (scaling) חסכונית של זרימות עבודה בגנומיקה ללא הוצאות הון משמעותיות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים על ידי אפשור עיבוד דגימות ברב-תפוקה וניתן לשחזור עבור פרויקטים מרובים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בסיסית בביולוגיה מולקולרית והיכרות עם פרוטוקולים של עמודי ספין (spin column).
- דורש גישה לרוטורים סטנדרטיים של פלטות צנטריפוגה ולרכיבי מעמד המודפסים בתלת-ממד.
- דורש סטנדרטיזציה בין צוותים להבטחת תפעול עקבי ואיכות נתונים.
- ניתן להתאמה לסוגי דגימות שונים ולצרכי תפוקה שונים, תחת מגבלות קיבולת הצנטריפוגה.
- תלוי בזמינות של חומרה בקוד פתוח וביכולות ייצור מקומיות.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:28
Preparation of 3D-Printed Equipment
1:34
Preparation of Bacterial Culture and Cell Lysate
2:43
Preparation of Lysate Using Titanium Dioxide Co-Precipitation
3:41
Assembly of the Filtration Unit for Lysate Clearance and DNA Binding
4:27
Washing and Elution of DNA
5:32
Results
6:22
Conclusion
