זיהוי הזדקנות באמצעות אור מוחזר בחלק הווסקולרי סטרומלי שומני

אנו חוקרים הזדקנות של שומניות במגוון מצבים מטבוליים של שומן, כמו השמנה והיפראינסולינמיה. בדיקות SABG מסורתיות מבוססות ברייטפילד לא ממש מאפשרות מולטיפלקסינג והן מאוד סובייקטיביות. הפרוטוקול החדש שלנו פחות סובייקטיבי ומאפשר מולטיפלקסינג.

כדי להתחיל, שלפו את הצינור המכיל את רקמת השומן האנושית. הומוגניזציה של 10 גרם רקמת שומן והוספה אותה לצינור המכיל 0.05% אנזים קולגני מסוג אחד כדי לקבל כמיליון תאי שבר וסקולרי סטרומלי, או SVF. אליקווט 500,000 תאים לכל צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר.

הוסף מיליליטר אחד של 2% פאראפורמלדהיד לצינור לקיבוע התאים. לאחר מכן, דגרו על נדנדה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. צנטריפוגה ב-600G למשך 10 דקות והסר את הסופרנטנט.

הכינו את תמיסת הצביעה X-Gal באמצעות ערכת צביעת הזקנה בטא-גלקטוזידאז לפי הוראות היצרן. הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת הצביעה לשלושה צינורות טריים. ולהתאים את ה-pH לחמש, שש ושמונה באמצעות תמיסות של חומצה הידרוכלורית מולרית אחת או תמיסות הידרוקסיד נתרן מולרית אחת.

השתמש במד pH מכויל כדי לאמת את ה-pH. הוסיפו את תמיסת הצביעה X-Gal המותאמת ל-pH לכל אחת מהשפופרות המסומנות המכילה 500,000 תאים. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ללא פחמן דו-חמצני.

צנטריפוגה את התאים ב-600G למשך 10 דקות. לאחר הסרת הסופרנטנט, שטוף את התאים עם PBS. ובצנטריפוגה שוב ב-600G למשך 10 דקות.

לאחר הסרת הסופרנטנט, כדי לזהות תאי אנדותל בתוך ה-SVF ההטרוגני, יש לדגור את התאים עם CD31 ספציפי לתאי האנדותל או לשלוט בנוגדנים ראשוניים של IgG בארבע מעלות צלזיוס במהלך הלילה. שטפו את התאים שלוש פעמים עם 0.1% PBST למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על נדנדה כדי להסיר נוגדנים ראשוניים לא קשורים. וצנטריפוגה ב-600G למשך 10 דקות.

לאחר השלכת הסופרנאנט, דגרו את התאים בנוגדן משני למשך שעה בטמפרטורת החדר על רוקר. צנטריפוגה ב-600 גרם למשך 10 דקות להסרת תמיסת צביעת נוגדנים משנית. שטוף את התאים שלוש פעמים באמצעות PBST ואז צנטריפוגה כפי שהודגם קודם.

להחזיר את התאים במתקן האנטיפייד. הפיפט את תליית התא על מחסניות מיקרוסקופ ומתייבש ללילה בטמפרטורת החדר כדי לשתק את התאים. למחרת, הוסף 100 מיקרוליטר של 100% גליצרול.

הניחו כיסוי מעל ואטמו אותו עם לק. הנח את השקופית המוכנה על במה של מיקרוסקופ קונפוקלי. בממשק תוכנת המיקרוסקופ, בחר באפשרות Light Path והתאם את הגדרת מפצל הקרן ל-T90R10.

לאחר מכן, בדוק את ערכי אורך הגל החיתוך עבור המראות הדיקרואיות המשניות, או SDM, בהגדרת המראה. בתפריט הגלאי, לחץ על אפשרות בחירת צבע וגלאי כדי להקצות ערוצים ואורכי גל של גירוי. לאחר מכן, הגדר את ערכי אחוזי עוצמת הלייזר עבור כל לייזר ספציפי בטווח של 10 עד 15%. בתפריט הסדרה, תחת סעיף LSM, הפעל את אפשרות Z למצב הפעלה. הגדר את גודל שלב ה-Z לאופטימלי של 0.74 מיקרומטר.

לאחר מכן, תחת תפריט Z Section, הזן את הערך לשדה התחל והגדר מחסנית Z בהתבסס על אות הממברנה כדי ללכוד את כל נפח התא. בפאנל Acquire, הזן את שם הקובץ ומיקום שמירת הקובץ בשדה הקלט של LSM. ולחץ על LSM Start כדי להתחיל רכישת תמונה.

ושמור את הקבצים בפורמט מיקרוסקופ מקורי. לאחר הרכישה, יש להשתמש בחצי הניווט Z כדי לאמת את האות וההתפלגות המוקדית של צבעים שונים לאורך כל ערימת ה-Z. העלה את קובץ ה-OIR השמור לתמונה J.In חלון האפשרויות לייבוא ב-Bio-Formats, לחץ על אוקיי.

לחצו על תפריט תמונות כדי לפתוח את הקובץ. ומהתפריט הנפתח בחר צבע, ואז אפשרות פיצול ערוצים כדי לפתוח את הערוצים השונים כחלונות נפרדים. לאחר מכן, כוון את ניגודיות הבהירות ואופטימיזציה של ערכי ה-LUT באמצעות אפשרות Adjust בתפריט התמונה לשיפור ההמחשה של התמונה.

השתמשו בסרגל הגלילה של ציר ה-Z בתחתית המסגרת כדי לעבור בין החלקים האופטיים ולאמת תכונות סלולריות לאורך כל הערימה. בתפריט התמונה, בחרו ב-Stack. לאחר מכן, בחרו בפונקציית פרויקט Z ליצירת הקרנות עוצמה מסוכמת של התמונה הקונפוקלית התלת-ממדית.

בתיבת הדיאלוג של Z Projection, הגדר את טווחי הפרוסות של התחלה ועצירה. בחר את סוג ההקרנה ולחץ על אישור כדי לקבל את התמונה המורכבת הדו-ממדית הסופית. לאחר מכן, נווט לתפריט התמונה.

בחר באפשרות Type כדי להתאים את סוג התמונה ל-16 ביט. לאחר מכן, שמור וייצא את התמונות כקבצי TIF 16 ביט. ייבא את התמונות השמורות לגרסה 4.2.8 של CellProfiler לצורך סגמנטציה אוטומטית של תאים, כימות עוצמת האור המוחזר לכל תא, וייצא ערכי מדידת העוצמה לגיליון אלקטרוני.

בגיליון האלקטרוני, הגדירו את הסף לחיוביות בטא-גלקטוזידאז הקשורה להזדקנות כסכום עוצמת האור המוחזר הממוצעת של תנאי pH 8 בתוספת שלוש סטיות תקן. סווגו את התאים בתנאי pH 6 כחיוביים בטא-גלקטוזידאז הקשורים להזדקנות אם ערכי העוצמה שלהם עולים על הסף שנקבע. צביעת בטא-גלקטוזידאז הקשורה להזדקנות באור מוחזר של תאי SVF אנושיים יצרה דפוסים ברורים וניתנים לשחזור בשלוש רמות pH.

ב-pH 5, רוב התאים הראו אות חזק בשל פעילות אנזימית אנדוגנית גבוהה. בערך התקן של pH 6 במבחן, עוצמת האות ותדר האות ירדו, מה שאפשר זיהוי ספציפי של תאי בטא-גלקטוזידאז הקשורים להזדקנות. ב-pH 8, האות היה מינימלי, וזה שימש כבסיס להגדרת סף החיוביות.

בדיקות רגישות גילוי הראו כי הדמיית האור המוחזר עקפה את Brightfield בכל תנאי ה-pH. ב-pH 5, האור המוחזר הראה משקעים חזקים מסוג X-Gal, בעוד שברייטפילד תפס רק את המשקעים הגדולים ביותר. ב-pH 6, אור מוחזר זיהה תאים חיוביים שהיו חלשים או מפוזרים מדי כדי לראות ב-Brightfield.

ב-pH 8, הדמיית אור מוחזר זיהתה אות מינימלי, תואם לפעילות אנזימטית נמוכה, ועקפה את Brightfield בזיהוי משקעי X-Gal ברמות פעילות בינוניות ונמוכות. בסך הכול, תהליך הדמיית האור המוחזר הזה משלב זיהוי סימולטני של בטא-גלקטוזידאז הקשור להזדקנות ושל סמנים מבוססי פלואורסצנציה, כגון CD31, ומסייע בהערכות הזדקנות רב-תכונתיות ברזולוציה של תא יחיד באוכלוסיות SVF הטרוגניות. פרוטוקול זה מאפשר מדידות פעילות SABG רגישות וכמותיות, תוך שהוא מאפשר בו זמנית גם סימני הזדקנה נוספים, וגם סמנים תאיים נוספים.

האתגר העיקרי, הייתי אומר, הוא ההגדרה הראשונית של מיקרוסקופיה. אבל ברגע שזה אופטימלי, אפשר להשתמש באותם פרמטרים של רכישה בכל הניסויים. מחקרים עתידיים יוכלו לשלב את הבדיקה הזו עם סמנים תת-תאיים אחרים כדי לבדוק כיצד SABG קשור לתהליכים תאיים שונים.