מכשיר מיליליפלואידי מתרבות רציפה לחקר אשריכיה קולי בתנאים תזונתיים נמוכים ומשתנים

המחקר שלי מתמקד בבחינת האופן שבו חיידקים מסתגלים פיזיולוגית לתנאים דלים ומשתנים של חומרים תזונתיים האופייניים לסביבות טבעיות. מערכות גידול קונבנציונליות משחזרות בצורה לקויה תנאי תזונה דינמיים נמוכים, בעוד שהמערכת שלנו מאפשרת גידול בתנאים סביבתיים רלוונטיים אלו. הכינו את התרבית ללילה יום לפני הניסוי.

הכינו טרום-תרבית על ידי הוספת שישה מיקרוליטרים של תרבית הלילה לצינור המכיל שישה מיליליטר של מדיה מוגדרת עשירה מלאה, או RDM. חלק את התערובת שווה בשווה לשני צינורות תרבית של 15 מיליליטר וסמן אותן כ-A ו-B. דגר את שני הצינורות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, עם ניעור ב-200 סל"ד. יש לנטר את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר באמצעות שפופרת B, ואל תמשיך עד שהצפיפות האופטית מגיעה לכ-0.5.

במהלך הדגירה, יש להכין את מדיום ה-Low RDM, ולהקצה את הנפח הכולל בין הבקבוקים לנקודות זמן שונות. לאחר מכן אטום כל בקבוק עם פקקים עם שלושה צינורות. חבר את צינור הסיליקון השלישי הרחב ביותר למסנן אוורור בגודל 0.2 מיקרומטר להחלפת אוויר סטרילית.

חבר קצה אחד של כל צינור פריסטלטי עם מחברי מנעול Luer זכריים לצינורות הסיליקון בקוטר הקטן יותר. השאירו את מכסה נייר האלומיניום על מחבר הנעילה הזכרי החופשי של Luer בקצה השני של הצינורות הפריסטלטיים עד שהניסוי מתחיל כדי למנוע זיהום. הניחו את הבקבוקים והמשאבה הפריסטלטית באינקובטור על 37 מעלות צלזיוס.

אבטח את כל צינורות הפריסטלטיקה לתעלות של אותו ראש משאבה, כדי להבטיח קצב זרימה זהה בכל המסננים. מדלל את הקדם-תרבות ביחס של אחד ל-10 על ידי הוספת 600 מיקרוליטר של תרבית לצינור המכיל 5.4 מיליליטר של RDM נמוך. באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד, הכנס מיליליטר אחד של תרבית מדוללת לכל אחד מששת מסנני פוליווינילידן פלואוריד (PVDF) בקוטר 0.45 מיקרומטר.

לאחר שטיפת שסתומי בדיקה חד-כיווניים במים אולטרה-טהורים באוטוקלב, חברו אותם לכל קצה של המסננים. הסר את מכסי נייר האלומיניום מהחיבורים של הצינורות. חבר כל פילטר לאביזרי הצינורות הפריסטלטיים.

הגדר את קצב הזרימה לשני מיליליטר לדקה במשאבה הפריסטלטית. הנח שקע פסולת מתחת למסננים כדי לאסוף את הזרימה החוצה, והתחל את הזרימה. לאחר שעתיים, נתק אחד המסננים שמחובר לבקבוק של ליטר אחד, פתח את שסתומי הבדיקה חד-כיווניים, והנח את המסנן בצינור צנטריפוגה בנפח 50 מיליליטר כשהכניסה פונה כלפי מטה.

צנטריפוגה ב-2,000 גרם לשתי דקות. באמצעות חותך צינורות סטרילי, לחץ בעדינות בקצה היציאה של מארז הפלסטיק כדי לפתוח את המסנן. שחרר את הצילינדר הפנימי והשליך את החלק המכיל ממברנה.

שטוף את הקירות הפנימיים של מעטפת המסנן עם מדיום התרבית שנאסף. מדדו את הנפח הכולל שנאסף באמצעות פיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר. קח שלושה אליקוות של 100 מיקרוליטר מהדגימה וקבע אותם עם גלוטראלדהיד לריכוז סופי של 1.5%. נתק את המסננים המתאימים בנקודות זמן נוספות וחזור על תהליך האיסוף.

סמנו את הדגימות שנאספו לפי נקודות הזמן המתאימות. סמנו את הדגימות עם צבע DNA פלואורסצנטי, וספרו את התאים באמצעות ציטומטריית זרימה. עם הזמן, ספירות התאים המומרת ב-log 10 עקבו אחרי מסלולים ליניאריים, מה שמעיד על גדילה מעריכית בכל התנאים.

קצבי הגידול היו כ-0.88 לשעה במצב RDM של 0.5%, 0.64 לשעה במצב 0.25%, ו-0.18 לשעה במצב 0.01%. ספירת התאים הגיעה עד מיליארד תאים לכל דגימה, מה שמראה כי מכשיר התרבית הרציפה המיליפלואידי, או MCCD, תומך הן בצמיחה אקספוננציאלית והן בתפוקת ביומסה גבוהה בריכוזי ננומולר עד מיקרומולר. תאים שגדלו ב-0.5% RDM היו בעלי אורך תא ממוצע גדול יותר מאשר תאים שגדלו ב-0.01% RDM.

האתגר המרכזי בגידול דלי חומרים מזינים הוא שמירה על צפיפות תאים מספקת למניעת סתימות, הצטברות לחץ ודלדול חומרים מזינים. לאחר הליך זה, ניתן לאסוף תאים לניתוחים נוספים במורד הזרם, כולל פרוטאומיקה, מטבולומיקה ושיטות אומיקס נוספות. מחקרים עתידיים יוכלו לחקור הסתגלות מיקרואורגנית להגבלת ותנודות של חומרים מזינים על ידי שילוב פרוטוקול זה עם ניתוח אומי כמותי.